家猪13/17罗伯逊易位染色体着丝粒的研究 第6页
Breneman等于1993年较早地把FISH技术运用于罗伯逊易位的研究。他使用染色体特异的DNA探针成功地分辨出小鼠(Mus musculus)中的2号与8号染色体之间的罗伯逊易位,并指出在研究诸如小鼠等几乎全部由形态、大小接近的亚端着丝粒染色体组成的核型时,要比G带法具有明显的优越性[84]。Sullivan等则运用双色FISH(dual-color FISH)研究了人类罗伯逊易位染色体上双着丝粒的活性问题[85]。199年,Baulch等又运用多色FISH(Multi-color FISH)研究了携带罗伯逊易位的雄性小鼠产生非整倍性精子频率变化问题。此小鼠具有三个罗伯逊易位染色体:Rob(2;8)2Lub,Rob(812)22Lub和Rob(8;14)16Rma;每一个易位都涉及到了8号染色体,因此他使用了8号染色体特异探针及X染色体的特异探针同时进行了检测[86]。
将罗伯逊易位染色体分离,建成相应的染色体文库(chromosome library),对深入研究罗伯逊易位是十分必要的。Bahary等首先利用荧光激活染色体分选法(fluorescent-acti-vated chromosome sorting),从Rob(4;6)2Bnr罗伯逊易位的小鼠细胞系中“分拣”纯化出4;6罗伯逊易位染色体,然后从易位染色体制备出DNA片段,再亚克隆到λgt10载体中,得到了一个由4.6×105克隆组成的文库,这个文库含有4和6号染色体70%的片段[87]。
显微解剖(microdissection)和PCR技术相结合应用于探针的制备,大大推动了罗伯逊易位的研究。Thangavelu等利用显微解剖技术从一个表型正常的女性染色体中分离出一条中着丝粒Marker染色体,并制成相应的探针,通过FISH对此女性的核型进行检验,结果证实,这个中着丝粒Marker是由罗伯逊易位引起的[88]。Liechty等则利用显微解剖技术从未染色的小鼠核型中分离出Rob(9;19)的罗伯逊易位染色体并制备出整条染色体的涂染探针[89]。PCR技术可以把已有的DNA探针进行大量的扩增,Breneman等先从小鼠中分离出Rob(2;8)染色体,随后利用DOP-PCR(degenerate oligonu-cleotide prime-PCR)技术对它们的DNA进行了扩增,并且详细介绍了扩增过程。1997年,Burkin等则利用同样的方法对携带Rob绵羊(Ovis aries)的细胞系进行了研究[90]。Schmidt等又把QF-PCR(quantitative fluorescent-PCR)技术运用到产前诊断(prenatal diagnosis)中,并发现了两例不平衡罗伯逊易位携带者(13三体和21三体)[91]。
除了以上的技术外,限制性片段长度多态性(RFLP)分析[92,93]、DNA印迹杂交[94](Southern blot)等也常见于罗伯逊易位的研究中。
第二章 猪13/17罗伯逊易位染色体着丝粒区域DNA文库的构建
1 试验材料
13/17罗伯逊易位猪，来自青岛农业大学实习基地。前腔静脉采血，肝素钠抗凝，4℃保存。
1.1 主要仪器及试剂
RPMI1640培养基 美国GIBCO
小牛血清 杭州四季青
秋水仙素 美国SIGMA
PMD-19T载体 TaKaRa宝生物工程有限公司
电热恒温培养箱420型 中国龙口市先科仪器公司
烘干箱210型 中国龙口市先科仪器公司
荧光显微镜及摄相系统 日本OLYMPUS
台式低速离心机TDL-60B 上海安亭科学仪器厂
电热恒温水浴锅HW•SY21-K 北京市长风仪器仪表公司
显微操作系统 日本尼康
1.2主要试剂的配制
（1）培养基：RPMI1640（日本产） 4mL
小牛血清（国产） 1mL
青霉素 500IU
链霉素 500IU
用5%NaHCO3调至PH为7.2。
（2）肝素钠用生理盐水配成500单位/mL。
（3）秋水仙素5μg/mLl。
（以上溶液都要经灭菌处理，其中培养基要经G6抽滤灭菌，后两种溶液经高压灭菌）
（4）0.075MKCl溶液：称取5.591gKCl，溶于1000mL蒸馏水中。
（5）刀豆素(ConA)0.20mg/mL。
（6）固定液：甲醇与冰醋酸以3：1的比例混合配制。
（7）0.01M磷酸缓冲液（PBS），PH6.8。
（8）Giemsa原液：称取Giemsa粉1g置于玻璃乳钵中，加几滴甘油，反复研磨（成浓糊状）约1h，直至看不到颗粒为止，加甘油33mL，边加甘油边搅，然后置于60℃温箱2h，然后倾入小烧杯，用33mL甲醇分次加入乳钵，使乳钵附着的染料洗下，然后用一根细玻璃棒在小烧杯中慢慢搅拌均匀，最后倒入棕色小口瓶或滴瓶中。
(9)LB液体培养基
胰蛋白胨10.0g，酵母抽提物5.0g，NaCl10.0g，ddH2O1000mL完全溶解，用5mol/LNaOH调至pH=7.0。
(10)LB固体培养基
胰蛋白胨10.0g，酵母抽提物5.0g，NaCl10.0g，ddH2O1000mL完全溶解，用5mol/LNaOH调至pH=7.0，加入琼脂15.0g。
2试验方法
2.1染色体标本的制备
2.1.1 综合培养基的分装
无菌制备综合培养基，分装于培养瓶中，然后置冰箱中4℃保存。每瓶含有综合培养基5mL，用前取出解冻，每瓶培养基加ConA0.2mL。
2.1.2 采血
首先用5mL的注射器抽取少许500单位/mL的肝素湿润管壁，然后对猪进行前腔静脉采血。
2.1.3 淋巴细胞培养毕业论文
http://www.751com.cn/ 论文网
http://www.751com.cn/采用半微量全血培养法。每5mL培养基接种肝素血0.3-0.5mL在38.1℃培养箱培养72h。
2.1.4 秋水仙素处理
终止培养前4-6h左右，每个培养瓶加入3-5滴5μg/mL的秋水仙素，轻轻摇匀，使最终培养物浓度为0.02-0.03μg/mL，以使细胞抑制在分裂中期。放回培养箱继续培养4-6h即可进行染色体制片。
2.1.5 标本片制作与观察
（1）平衡离心管：将各瓶中的培养物用吸管吹打混匀后，全部转移到10mL的离心管中，用1000r/min 离心7min；离心后弃上清液，留约0.5mL左右的液体在离心管中。
（2）加入0.075M KCL溶液8ml，用吸管轻轻吹匀细胞，室温静置低渗20min，再加入10滴甲醇：冰醋酸（3：1）混匀进行预固定，用吸管吹匀后平衡，用1000r/min
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