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家猪13/17罗伯逊易位染色体着丝粒的研究第7页

更新时间：2010-5-23: 来源：毕业论文

家猪13/17罗伯逊易位染色体着丝粒的研究第7页
离心7min，弃上清液。
（3）固定Ⅰ：加入甲醇：冰醋酸（3：1）固定至8mL，吸管吹匀后后静置20min，1000r/min离心7min，再弃上清液。
（4）固定Ⅱ：加入甲醇：冰醋酸（3：1）4-5mL，吹匀后静置30min，1000r/min离心7min；弃上清液，加入0.5mL甲醇：冰醋酸（3：1）混匀制成细胞悬液。
（5）制片：用吸管吸细胞悬液，滴两滴于冰冻的载波片上，待玻片自然干燥后，用1：10的Giemsa染液染色10-15min，用蒸馏水将多余的染料冲洗干净，自然干燥。
2.1.6 染色体核型鉴定
在低倍镜和中倍镜下，寻找分散良好、不重叠的中期分裂相，在转至油镜下进行染色体计数。根据已证明的三种不同核型猪染色体的数目（13/17易位纯合仔猪2n=36,杂合子2n=37，正常猪2n=38），对试验猪群进行分类，并进行标记和记录。挑选分裂相良好的染色体标本再进行滴片，不染色，剩余的悬浮液保存在1.5ml离心管中于-20℃，以备荧光原位杂交之用。
2.2 显微切割获得13/17易位染色体着丝粒区域
挑选挑选分裂相良好的染色体标本（2n=37）。在显微操作仪下用尖端直径不超过0.5μm玻璃针进行13/17易位染色体切割并分离出着丝粒区域。将吸附有染色体的针尖折断于Eppendorf管中，加入蛋白酶于55℃消化1 h,然后94℃水浴10 min使酶失活。
2.3着丝粒区域DNA文库的构建
2.3.1 DOP-PCR扩增
PCR扩增在含有染色体的Eppendorf管中进行。
PCR反应总体积为                  50µL
10×PCR Buffer                   5µL
dNTPs Mixture                    4µL
DOP引物                          2µL
Taq DNA polymerase               0.5µL
dd H2O                           38.5µL
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1 min，35℃退火 1 min，72℃延伸1 min (35个循环)；72℃延伸10min。以1µL PCR产物为模板进行第二次PCR（25µL体系），反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸1 min (35个循环)；72℃延伸10min。
2.3.2 PCR 产物纯化
PCR 产物纯化：PCR产物回收纯化试剂盒
2.3.3 PCR产物克隆连接反应
本实验选择的质粒载体是 pMD-19T Vector，其宿主菌为大肠杆菌DH5a，通过IPTG和X-gal 进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆。
连接体系： PMD-19T vector     1µL
            PCR纯化产物       1µL
dd H2O             3µL
SolutionⅠ         5µL
共计              10µL
16℃ 反应30 min或室温过夜。
2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
原理：新鲜培养的细菌细胞当遇到高效致敏剂时，其细胞表面会形成微小的空洞，有利于外源 DNA 分子进入细胞内，从而形成转化。
利用CaCl2法制备感受态细胞：
（1）将保存的大肠杆菌DH5α菌株划线于不含氨苄的LB琼脂平板上，培养12-16h
（2）挑取单菌落，接种于10mL LB培养基中，37℃摇床上培养过夜
（3）次日，取1mL菌液加入到100mL新鲜LB液体培养基中，37℃下280-300rpm振摇培养至OD600为0.5左右。冰浴菌液10min，4000rpm离心10min
（4）弃上清，倒置离心管1min，流尽剩余液体
（5）加入10mL用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，重悬细胞沉淀，置于冰上30min
（6）4℃ 4000rpm，离心10min
（7）弃上清，再加入2mL预冷的CaCl2溶液重悬菌体细胞
（8）每管加入300μL的灭菌甘油
（9）用冷却的无菌枪头，将之分装到预冷的1.5mL Eppendorf 离心管中，每管200μL，-70℃保存备用，4℃可保存一周（感受态细胞在24h内转化效率最高）
2.3.5 转化及阳性克隆的初步筛选
取待转化的质粒1μg即连接产物5μL于200μL大肠杆菌感受态细胞，并充分混匀后，冰浴30min，勿动
42℃水浴热击90sec，立即置于冰浴中1-2min，勿动
加入800μL不含氨苄的LB液体培养基，37℃，150rpm，细胞复苏1h
同时，在含有Amp的LB固体琼脂平板上均匀涂布4μLIPTG和40μLX-gal
转化产物温育之后，4000rpm，离心2min，去除一些上液，取150μL 涂布于平板上(含氨苄青霉素，X-gal 和IPTG

37℃培养过夜
将平板4℃放置数小时，使蓝斑充分显色
2.3.6菌液PCR鉴定
挑取阳性菌落，37℃摇菌过夜，以菌液为模板进行PCR以排除蓝白斑筛选的假阳性。
菌液PCR反应体系： 10×PCR Buffer         2µL
dNTPs Mixture          2µL
Taq DNA polymerase     0.2µL
通用引物M13 RV         1µL
通用引物M13 M3         1µL
菌液                    2µL
dd H2O                  16.8µL
共计                    25µL
菌液PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s (35个循环) ；72℃延伸10min。
2.3.7 克隆子序列分析
随机挑选克隆子传代培养。提取质粒后送上海生工测序。用NCBI的Blast工具及DNAMAN等软件分析测序结果。
3 结果与分析
3.1显微切割获得13/17易位染色体着丝粒区域
13/17易位染色体与1号染色体的大小、形态比较相似，但1号染色体相对长度小于13/17易位染色体，同时1号染色体的短臂明显大于13/17易位染色体的短臂。