家猪13/17罗伯逊易位染色体着丝粒的研究 第8页
图2-1：显微切割获得13/17易位染色体着丝粒区域
Fig.2-1 centric region was obtained through microdissection
3.2 DOP-PCR产物检测结果
DOP-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测获得100~2000bp左右的连续带。（如图2所示）
图2-2：DOP-PCR产物检测结果
M：DL2000 DNA marker；1~3：DOP-PCR产物。
Fig.2-2 detection of DOP-PCR product
M：DL2000 DNA marker；1~3：DOP-PCR product.
3.3菌液PCR结果 毕业论文
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http://www.751com.cn/菌液PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测筛选出阳性克隆。在构建的13/17易位染色体文库中，克隆片段大小为100~600bp，平均为300bp左右。 (如图3所示)
图2-3：阳性鉴定
M：DL2000 DNA marker；1：假阳性克隆；2~10：阳性克隆。
Fig.2-3 masc verification
M：DL2000 DNA marker；1：false positive clone；2~10：masc clone
3.4 序列分析结果
图2-4 克隆子091011NCBI比对结果
Fig.2-4 clone 091011 blast in NCBI
克隆子091011经比对发现179bp序列与NCBI上所提交的野猪胰岛素样生长因子Ⅰ序列同源性为100%。克隆子091011即为胰岛素样生长因子Ⅰ部分序列（如图4）。
图2-5胰岛素样生长因子ⅠMap viewer 搜索结果
Fig. 2-5 Search results of IGFⅠin Map viewer
用Map viewer查找猪胰岛素样生长因子Ⅰ在基因组中的定位发现胰岛素样生长因子Ⅰ序列位于第5号染色体（如图5）。出现此种情况的原因可能是在显微切割的操作中存在非易位染色体的污染从而导致将非易位染色体片段克隆。
4. 讨论
4.1染色体显微切割
染色体显微切割分手工切割[95]和激光切割法[96]。手工切割造成污染的可能较大，激光切割法污染小，但需要较高的设备条件，同时激光光束的位置控制和光束强度调节十分困难。本实验采用的微玻璃针手工切割法在前人的基础上采用一系列控制污染的措施，最大限度降低了污染，实验结果证明了显微切割的可靠性。同时，用于显微分离的染色体标本不仅要求有大量分散较好的中期分裂相，而且要求背景干净、无外源DNA的污染以及尽可能缩短固定时间以降低固定液中冰乙酸的脱嘌呤作用。
4.2 DOP-PCR方法
从生物体的整个基因组入手,如筛选特定染色体的ＤＮＡ文库、用消减法克隆ＤＮＡ、染色体滑步或跳跃法分离基因等,因为技术程序相当冗长繁杂,难于广泛应用。而运用细胞遗传学的显微操作技术从染色体标本上直接分离特定染色体甚至染色体特定片段,再通过分子生物学方法将其ＤＮＡ克隆,无疑是一条捷径。PCR技术的介入使得染色体显微切割之后的微克隆效率大大提高，利用较少的染色体或染色体片段为底物经PCR扩增后可得到足够的DNA，能满足一系列分子生物学操作的需求。Wesley等(1989) [97],Telenius等(1992)发展了利用兼并寡核苷酸随机扩增染色体DNA的方法(degenerate oligonucleotide primed PCR)。Telenius等(1992)发展了现在广泛使用的DOP-PCR方法，其引物序列为5'-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3'，按功能可分为三部分。3'端6个特异性碱基使得引物与模板DNA进行特异性退火，中间6个简并寡核苷酸对扩增起稳定作用，5'端为包含有一个限制性内切酶(XhoI)的10个碱基的特异序列，便于扩增片段的克隆[98]。本实验采用此引物经两轮扩增，获得100bp~2000bp左右连续片段，为ＤＮＡ文库的构建提供了原始材料。
第三章 猪13/17罗伯逊易位染色体着丝粒特异性探针筛选
1 试验材料
1.1 主要试剂及仪器
硫酸葡聚糖 美国 AMRESCO
Tween-20 上海生工
DIG DNA Labeling Kit 瑞士Roche公司
Anti-Digoxigenin-Fluorescence 瑞士Roche公司
Blocking reagent 瑞士Roche公司
杂交箱 美国hoefer公司
电热恒温水浴箱HW•SY21-K 北京市长风仪器仪表公司
荧光显微镜及摄相系统 日本OLYMPUS
1.2主要试剂的配制
（1）20×SSC：3mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，调pH=7.0，高压灭菌。
(2)洗液Ⅰ：50%的甲酰胺， 2×SSC（pH7.0）;
洗液Ⅱ：2×SSC（pH7.0）;
洗液Ⅲ：4×SSC（pH7.0），0.05%的吐温20。
（3）变性液：70％去离子甲酰胺，2×SSC。
（4）杂交液：10％硫酸葡聚糖，50％去离子甲酰胺，2×SSC。
（5）马来酸缓冲液：0.1mol/L马来酸，0.15mol/LNaCl，NaOH调pH值为7.5，灭菌后备用。
（6）封闭剂（Blocking stock solution）：按10%（W/V）溶解Blocking reagent马来酸缓冲液中，灭菌后8℃保存备用。
（7）封闭液（Blocking solution）：用10×封闭剂储存液和马来酸缓冲液按1:10稀释成1×工作液，现用现配。
（8）DAPI染液：避光条件下，用4ml水使其溶解，使其终浓度为2.5mg/mL作为储存液，-20℃避光保存；工作液可用甲醇溶解成1μg/ml，4℃避光保存。
（9）抗体溶液：将Anti-Digoxigenin-Fluorescence抗体按1:5000稀释于封闭液中，现用现配。
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