抗菌肽生产现状及合成结构分析纯化研究
摘 要抗菌肽是生物体抵御外源性病原微生物的入侵而产生的一类小分子多肽，与传统的抗生素相比具有分子量小、抗菌谱广、热稳定性好、抗菌机理独特等优点。利用抗菌肽替代传统抗生素，对提高畜产品品质，推动绿色畜牧业的发展有着非常重要的意义。文章对普莱医药生产现状及抗菌肽的合成、结构、分析纯化等方面的实验操作进行了系统的分析，并阐述了目前在抗菌肽合成中存在的问题，以期为抗菌肽的更深层次的研究提供参考。
关键词：多肽 普莱 抗菌肽 生物学特性 作用机理 应用前景
目 录摘 要 1
目 录 2
前 言 3
一：企业所属行业的生产与经营状况 3
二：企业发展现状 3
三：论文写作目的和意义 4
正 文 5
一：生产（研究）现状综述 5
二：重点岗位生产操作内容及分析 6
（一）重点岗位生产操作内容 6
（二）多肽合成操作规程： 7
三：岗位操作常见问题及分析： 9
参考文献 11 毕业论文http://www.751com.cn
致 谢 12
前 言一：企业所属行业的生产与经营状况长春普莱医药生物技术有限公司是由留学加拿大和美国的加拿大籍华人陈育新博士创办的中外合资企业。公司于2006年9月落户于长春市高新区，作为重点项目得到了长春市高新技术产业区领导及政府的大力支持。本项目良好的市场前景和国际领先的技术水平，经长春高新区组织行业技术专家论证，已将其列为高新区2006年度重点招商和扶持项目。
普莱医药公司是一家以多肽类药物、化学药物的研究、开发与生产为主，并进行抗菌肽国家一类新药的研发与申报工作的高科技医药企业。
本项目是国际首创、拥有自主知识产权的高效、广谱抗菌肽新产品项目。目前项目已完成实验室研发阶段的全部工作，获得的多个高活性抗菌肽品种。目标是研发国家一类新药抗菌肽（多肽类抗生素），并进行规模化生产与销售
二：企业发展现状由于历史原因，我国医药企业生产集中度较低，远远低于发达国家的水平：我国现有6700余家制药企业，销售额前60名企业的生产集中度为35.7%，而世界前20名制药企业的销售额占到全球药品市场份额的60%左右。企业技术创新能力与国外企业相比极弱，生产的药品仿制率高达97%，创新药几近空白。
在公司成立运作过程中得到了诸多享誉世界的国内外著名的生物化学实验室和医药专家的加盟及支持，使公司具有坚实和可靠的技术后盾，及可以信赖的实验室数据。
三：论文写作目的和意义
实习对于每个人来说都是不同的对于每个人的感触也不同，我感觉实习让我学会了很多学校学不到的东西，通过实习让我了解到本专业的美好前景，和对我 以后的工作增加了信心，下面首先我来介绍几类对于人非常重要的多肽
第一个 抗肿瘤多肽 肿瘤的发生是多种因素作用的结果，但最终都要涉及癌基因的表达调控。现在已发现很多与肿瘤相关的基因以及对肿瘤产生作用的调控因子，筛选与这些基因及与调控因子特异结合的多肽，已成为寻找抗癌药物的新热点。如生长抑素已用于治疗消化系统内分泌肿瘤；美国学者发现了一个能在体内显著抑制腺癌的辣肽；瑞士科学家发现一个能诱导肿瘤细胞凋亡的八肽
第二个 抗菌活性肽 当昆虫受到外界环境刺激时会产生大量具有抗菌活性的阳离子多肽，目前已从中筛选出百余种抗菌肽。体内外实验证实,很多抗菌肽不仅有很强的抗菌、杀菌能力，而且还能杀死肿瘤细胞
第三个 诊断用多肽 多肽在诊断试剂中最主要的用途是用作抗原，检测相应病原生物的抗体。多肽抗原的特点是比天然微生物或寄生虫蛋白抗原的特异性强，且易于制备。现在用多肽抗原装配的抗体检测试剂包括：甲、乙、丙、庚型肝病病毒、艾滋病病毒、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒、梅毒螺旋体、囊虫、锥虫、莱姆病及类风湿等检测试剂。使用的多肽抗原大部分是从相应致病体的天然蛋白质内分析筛选获得，有些是从肽库内筛选获得的全新肽
然而我们企业就是研究第一类多肽我对我们企业很有信心。。
其次介绍一下多肽的合成
1.多肽合成的基本原理?
多肽固相合成法是多肽合成化學的一個重大的突破。它的最大特點是不必純化中間產物，合成過程可以連續進行，進而為多肽合成的自動化奠定了基礎。目前全自動多肽的合成，基本都是固相合成。其基本過程如下：
基於Fmoc化學合成，先將所要合成的目標多肽的C-端氨基酸的羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然後以這一氨基酸的氨基作為多肽合成的起點，同其他的氨基酸已經活化的羧基作用形成肽鍵，不斷重複這一過程，即可得到多肽。根據多肽的氨基酸組成不同，多肽後處理方式不同，純化方式也有差異。
2.做免疫用的多肽多長為合適?
答：一般約10-15個氨基酸，當然長一些免疫效果好一些，不過合成費用也會增加。MAP多肽則希望長度在15aa以上，效果較好。另外，10aa以下的多肽免疫效果比較差。
3.免疫用多肽的純度需要很高嗎?
答：一般而言， 免疫用Peptide，70-85%即可。
4.我們合成的多肽溶解性不好，多肽就有問題對嗎?
答：很難準確預測一個多肽的溶解性及合適的溶劑是什麼。如果多肽難以溶解就認為多肽合成有問題這個觀念並不正確。
5.多肽狀態是如何?如何保存儲存?
答：我們提供的多肽是粉末狀，一般為灰白色，組成不同，多肽粉末的顏色有差異，多肽一般長期保存需要避光保存，並應保存在-20度，短期可以保存在4度。可以短時間的話是以室溫運輸。
6.如何溶解多肽?
答：溶解多肽是非常複雜的事情，一般很難一下子確定合適的溶劑。通常是先取一點試驗，在沒有確定合適的溶劑前千萬不要合部溶解。
下列方法有助於您選擇合適的溶劑：
(1)判定多肽的電荷特定，設定酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)和C端COOH為-1；鹼性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)及N端NH2為+1,其他氨基酸的電荷為0。計算出將電荷數。
(2)如果淨電荷數 >0，多肽為鹼性，用水溶解：如果不溶解或溶解性不大，加入醋酸(10%以上)；如果多肽還不能溶解，加入少量TFA(25ul)溶解，然後加入500ul水稀釋。
(3)如果淨電荷數<0，多肽為酸性，用水溶解；如果不溶解或溶解性不大，加入氨水(25ul)溶解，然後加入500ul水稀釋。
(4)如果淨電荷數=0，多肽為中性，一般需要用有機溶劑如乙腈，甲醇或異丙醇，DMSO等溶解。還有人建議需要尿素來溶解疏水性很大的多肽。
7.非HPLC純化的多肽中有哪些雜質?
答：粗品和脫鹽級別的多肽中多肽和非多肽類雜質：如非全長多肽和多肽後處理的一些原料如DTT、TFA等
8.HPLC純化的多肽有哪些雜質?
答：經過HPLC純化的多肽，仍會有一些一些雜質存在，其中的雜質主要是短肽和微量TFA。
9.多長的多肽為合適?
答：多肽合成需要考慮多肽的長度，電荷，親疏水性等因素。長度越長，合成粗品的純度和產率都隨著降低，純化的難度和無法合成的幾率就會大些。當然多肽功能區的序列是無法改變的，但是為了多肽的順利合成，有時不得不在功能取的上下游增加一些輔助氨基酸，以改善多肽的溶解性和親疏水性。如果多肽太短，合成也可能有問題，主要問題是合成的多肽在後處理過程中有一定的難度，5肽以下的多肽，一般要有疏水的氨基酸，否則後處理難度加大。15個氨基酸殘基以下的多肽一般都可以得到滿意的產率和得率。
10.如何從多肽序列中判定多肽的溶解性?
(1)多肽中如果含有高比例的疏水性很強的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,Phe和Trp，多肽很難溶解與水性溶液中或根本不可能溶解。這些氨基酸無論是純化或合成，都有可能有問題。
(2)一般情況下疏水性氨基酸的比例<50%，不能連續5個連續aa為疏水性，帶電荷的氨基酸的(正電荷K,R,H,N-terminus,負電荷D,E,C- terminus)的比例達到20%，在多肽的N或C短如果能增加極性氨基酸，也可以改善溶解性。
11.為什麼含有Cys,Met,或Trp的多肽難合成?
答：含有Cys, Met,或Trp的多肽難以合成，同時難以獲得高純度的產品。主要因為這些基團不穩定，易氧化。這些多肽的使用和儲存都需要特別注意，避免反復開啟蓋子。
12.為什麼有些多肽的合成產率或純度會比較低?
答：多肽合成與引子合成有比較大的區別，不能合成的引子很少，但是不能合成的多肽經常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr這些氨基酸比鄰或重複時，多肽鏈在合成過程中不能完全舒展溶解，合成效率下降。以下幾種情形，合成效率和產物的純度都比較低，如：重複Pro,Ser-Ser，重複Asp，4個連續Gly等.
13.多肽是如何純化的?
答：多肽純化一般使用反相柱(如C8，C18等)，214nm。緩衝體系通常為含TFA的溶劑，pH 2.0 。Buffer A為含0.1%TFA in ddH2O，Buffer B為1%TFA/ACN/ pH 2.0。純化前用Buffer A溶解；如果溶解不好，用Buffer B溶解後，然後用Buffer A稀釋；對疏水性強的多肽，有時還需要加入少量的Formic Acid或醋酸。HPLC分析多肽粗產物，如果多肽不長(15aa以下)，一般會有主峰，主峰通常為全長產物；對於20aa以上的長肽，如果沒有主峰，HPLC需搭配Mass來判定分子量，進而確定哪個峰是所要合成的多肽。
正 文一：生产（研究）现状综述长春普莱医药生物技术有限公司是由留学加拿大和美国的加拿大籍华人陈育新博士创办的中外合资企业。公司于2006年9月落户于长春市高新区，作为重点项目得到了长春市高新技术产业区领导及政府的大力支持。本项目良好的市场前景和国际领先的技术水平，经长春高新区组织行业技术专家论证，已将其列为高新区2006年度重点招商和扶持项目。
公司的目标是在中国国内开展以细菌细胞膜为唯一靶点的、广谱、高效的抗菌肽的临床前开发研究，尽快进入临床试验阶段，并建立一个达到GMP标准的、具有相当生产规模的生物医药研发生产基地。计划在5年或更短的时间内，通过临床前研究、三期临床试验、并拿到新药证书和生产许可，使得该药物以注射类药物、口服药和外用药的方式成功上市。我们计划制造出世界上第一例真正意义上的广谱抗菌肽注射类药物。
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企业有自己的作息时间，并且都会严格遵守。就连中午休息间隙，每个员工都会把自己得区域整理得井然有序。在用餐问题上，企业也有自己的特色。那就是上至高层主管下至普通员工，吃的饭菜一律相同，没有任何的特殊化。
二：重点岗位生产操作内容及分析（一）重点岗位生产操作内容多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，任何一种蛋白质中都有肽键结构。大多数蛋白质的分子结构非常复杂，相对分子量在10万以上，并且分子高度压缩、折叠，形成了立体规则实体，正是这些复杂的结构严重影响机体的消化和吸收率。人体多肽物质来源于蛋白质营养，主要是两个方面，一是食物在消化过程中蛋白质产生多肽，被身体吸收，二是体内细胞利用蛋白质的降解物氨基酸直接合成。多肽和蛋白质的结构是一样的，都是由氨基酸构成，从氨基酸营养的角度来分析，两者是一样的。但是多肽的分子量比蛋白质小很多，而且具有一些蛋白质所没有的生理调节功能。
肽优于高蛋白（大分子蛋白质），两者功能大不相同。首先，肽是体现信息的信使，以引起各种各样不同的实效的正性或异性生理活动和生化反应调节；其次，活性高，在微量和低浓度的情况下，多肽都能发挥其独特的生理作用；第三，分子量小，易于改造，相对于蛋白质而言较易人工化学合成. 在这次实习中，我的岗位是实验研究技术员，负责每天的具体实验操作。例如：多肽的合成，冻干，分析，制备等等。其中，我们采用固相合成法来进行多肽的合成，固相合成法是多肽合成化学的一個重大的突破。它的最大特点是不必纯化中間产物，合成过程可以连续进行，进而为多肽合成的自动化奠定了基础。目前全自动多肽的合成，基本都是固相合成。其基本过程如下：
基于Fmoc化学合成，先将所要合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这一氨基酸的氨基作为多肽合成的起点，同其他的氨基酸已经活化的羧基作用形成肽鍵，不断重复这一过程，即可得到多肽。根据多肽的氨基酸组成不同，多肽后处理方式不同，纯化方式也有差异。
在我们具体操作中包括：Fmoc基团的脱保护，药品氨基酸的称量，氨基酸的活化，进行偶联反应，游离胺基的检测等。
（二）多肽合成操作规程： A. 树脂的浸泡活化
B. 树脂FMOC保护基脱保护
1.哌啶的DMF剪切溶液2.室温度控温摇床摇30min，减压抽滤除去剪切溶液
2.依次用有机试剂洗两遍，每次约3ml
C.氨基酸的活化：
称取L-Fmoc-AA,0活化试剂混匀，活化10分钟。氨基酸连接方法如下：
1.将活化的氨基酸加入到合成管后，再滴入分散剂，再加入悬浮剂使树脂悬，25度控温摇床上3.5h。,。
2.减压抽滤除去反应溶液，收集反应液，待检测合格后再倒掉