猪源双歧杆菌发酵工艺的研究 第4页
2 材料2.1样品来源 本实验分离样品来源于广州市良种猪场10、13和30日龄的健康小猪粪便。
2.2主要实验试剂
硫酸新霉素、盐酸-L-半胱氨酸、葡萄糖、大豆蛋白胨、胰蛋白胨 、酵母浸出膏、牛肉浸膏、番茄汁、琼脂、吐温-80、乳糖、可溶性淀粉、低聚果糖、麦芽汁培养基、营养肉汤培养基、氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、乙酸钠等、无菌纯化水、注射用蒸馏水。
2.3主要仪器与设备
超净工作台 、生化培养箱、厌氧培养箱、干燥器 、压力蒸汽消毒器 、移液枪 10～1000μL、精密pH计、电子天平、显微镜、烘箱、离心机、旋涡混合器、可见光分光光度计、电热恒温培养摇床、超低温冰箱、10升发酵罐、100升发酵罐。
3 双歧杆菌的分离和鉴定
3.1实验方法
3.1.1 分离纯化方法
样品稀释后，取0.1mL涂PTYG（培养基配置见附录I）平皿上，按“3.1.2”厌氧培养，37℃，72h。长出单菌落后逐个进行革兰氏染色和芽孢染色，挑选G+无芽孢、杆状且有“Y”和“V”形分支的菌株。再稀释，涂PTYG平皿，按以上方法重复2次，得到纯菌株后，用PTYG平皿保存。
3.1.2 厌氧培养
本实验采用在干燥器中将烛缸法与焦性没食子酸法相结合的厌氧方法。利用蜡烛燃烧耗尽干燥器内的氧气和焦性没食子酸在碱性溶液内能大量吸氧的原理进行厌氧培养。每 100cm3 空间用焦性没食子酸 1g ， 10 ％氢氧化钠。具体做法是将20gNaOH溶于100ml水中置干燥器内，点燃干燥器内蜡烛后在溶液中加入3g焦性没食子酸，盖上涂有凡士林密封干燥器盖子，蜡烛耗尽氧气熄灭后将干燥器置培养箱中。
经实验，我们从13和30日龄健康仔猪粪便中分离纯化出2株双歧杆菌。
3.1.3 仔猪肠道双歧杆菌的初步鉴定
经形态学及生理生化特性的初步鉴定，对分离驯化选育得到的两株猪源菌种1、猪源菌种2进行了生理生化特性的初步鉴定，试验结果见表3-1及表3-2。
表3－1 双歧杆菌糖发酵实验结果
菌株 木糖 纤文二糖 Ｄ核糖 半乳糖 果糖 乳糖 麦芽糖 淀粉 糊精 鼠李糖 甘露醇 葡萄糖 山梨醇 蔗糖 水杨素 阿拉伯糖毕业论文
http://www.751com.cn猪源菌种1猪源菌种2
表3－2 双歧杆菌属内种的生理生化特征表
菌
名 Ｄ核糖 阿拉伯糖 乳糖 纤文二糖 山梨醇 淀粉 麦芽糖 木糖 果糖 半乳糖 蔗糖 甘露醇 水杨苷
球双歧杆菌
注：+，阳性反应；-阴性反应；d，某些菌株阳性。
从表3-1结果可知，猪源菌种1、猪源菌种2不产生过氧化氢酶，M-R甲基红试验阳性，不产生吲哚，脲酶试验阴性（不分解尿素），不产生硫化氢，不液化明胶，不还原硝酸盐，精氨酸产氨试验阴性，发酵葡萄糖产酸不产气，符合双歧杆菌特性。糖发酵实验结果见表3－1，与双歧杆菌属内种的生理生化特征表中短双歧杆菌特性（见表3－2）符合，初步判断其为短双歧杆菌属。
因此，初步鉴定猪源菌种1、猪源菌种2均为双歧杆菌属菌。
通过上述对分离筛选到的猪源肠道益生菌进行驯化选育，获得适用于产业化的益生菌。
经初步鉴定后，把获得的2种猪源双歧杆菌送省微生物研究所进行了精确的鉴定，鉴定结果为：猪源菌种1为双歧杆菌（Bifidobacterium sp）；猪源菌种2为双歧杆菌（Bifidobacterium sp）。这些菌种遗传性能稳定，适用于产业化发酵生产。本文来自辣^文~论-文.网
3.2 本章小结
用PTYG培养基可从健康仔猪粪便中分离得到双歧杆菌。
双歧杆菌是一种对氧敏感的厌氧细菌，但经过驯化的双岐杆菌具有一定的氧耐受性能在微氧环境下繁殖，适合于实际发酵生产。
4仔猪肠道双歧杆菌的生长特性研究
4.1 操作方法
4.1.1 试验方法
将2mL菌种液（猪源菌种1 1mL+猪源菌种2 1mL）接入装有100mL培养液的三角瓶中。控制单一变量，实验组在温度、pH值、培养基相同的条件下，摇床培养24小时。再对发酵液进行测定。每个实验组做10个平行测定。
4.1.2 测定方法
接种培育24小时后，取发酵液经过10倍稀释，用分光光度计在600nm处测定吸光度。一组10个数据，求得平均值，绘制出生长特性曲线。
4.2 培养温度
温度是乳酸细菌生产培养的重要条件之一。微生物的生长与产物的形式都是在各种酶的催化下完成的。温度是保证酶活性的重要条件。因此在培养中必须保持稳定而合适的温度环境。双歧杆菌虽然在20~40℃温度范围内都可以生长。但最适生长温度仍是37±1℃。温度必需根据每一种菌来选择适宜的温度。在发酵罐中通过夹层或罐中的盘管通过冷热水进行调节控制的。
表4-1是不同温度下发酵液的OD600。表4-1 不同温度对猪源双歧杆菌发酵特性的影响
序号 温度 OD600
1 28 0.516
2 31 0.789
3 34 2.435
4 37 2.242
5 40 2.284
绘出生长曲线图4-1。
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