黄金梨授粉亲和性与花柱保护酶活性的关系
摘要：对黄金梨自交和杂交授粉过程中花粉在雌蕊上的生长动态进行了荧光观察。结果表明：黄金梨以幸水为父本异花授粉后20h，花粉管能够到达花柱的基部；自花授粉5 h后，花粉管长度达花柱长度1/5左右，授粉10h后，自花授粉的花粉管长度达柱头1/3左右，此后便停止伸长。在授粉后，三种保护酶的变化动态基本相似：0-5 h，自花授粉或异花授粉后花柱中SOD、POD、CAT活性均快速增加，但是异花授粉后，保护酶的酶活在5-10h内有所下降，此后逐渐增加，自花授粉后花柱内保护酶的酶活在第5 h以后逐渐下降。
论文关键词：黄金梨,自交授粉,杂交授粉,花粉管,保护酶
黄金梨是一种典型的配子体型自交不亲和植物，主要表现为自花授粉时，花粉虽然能在柱头上萌发，但是花粉管不能正常生长到达胚珠。这主要是由于在花柱中分泌表达了一种糖蛋白：S-RNase，该蛋白能够抑制与其基因型相同的花粉管的延伸。据报道，黄金梨（SS）与幸水梨（SS）的自交不亲和基因型不同，杂交时表现为亲和。花柱半离体培养与荧光显微观察方法相结合，是观察花粉管在花柱内延伸的一种直观有效的方法。在植物体内，SOD、POD等能够清除体内有害物质，起到文持机体内活性氧代谢、生物膜保护、防止细胞结构破坏等功能。据吴能表等对甘蓝(Brassicaoleracea)和芸芥(Erucasativa)的研究，柱头内保护酶在授粉后，随着时间的推移，酶的含量呈上升趋势。张雪梅等通过对苹果的研究发现，在授粉后24-72h，苹果自交亲和品种内源IAA与GA3的含量迅速上升，而ABA含量下降，自交不亲和品种则正好相反，在授粉后12-28h内，花柱ABA含量开始大幅上长。本研究以梨自交不亲和品种黄金梨为材料，结合荧光显微镜法观测花粉管行为，研究自交不亲和与杂交亲和后雌蕊内保护酶及内源激素的变化关系，以初步阐明保护酶、内源激素与亲和性的关系，为梨杂交育种克服受精前障碍提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
为武汉砂梨圃种植的黄金梨和幸水梨。于开花前3d套袋，在黄金梨开花当天，待柱头出现大量粘液后，利用事先准备好的花粉，对黄金梨进行自花授粉，并利用事先准备的幸水梨花粉进行杂交授粉，授粉后继续套袋。
1.2花粉管的观察
在完成授粉2、4、8、12、24、48和72h后，分别采集授粉后花柱，用FAA(70%酒精∶甲醛∶冰醋酸=89∶6∶5)固定。将固定的花柱从基部切下后，分别用50%、30%、20%和10%的酒精复水各10min后，蒸馏水洗2次（每次10分钟），再用8mol·L的NaOH软化12h，蒸馏水冲洗3次后，放入事先配制好的过夜脱色苯胺蓝溶液(0.1%苯胺蓝+0.1mol·L磷酸钾)中染色12h，整体压片后用奥林巴斯IX71荧光显微镜观察花粉管在花柱内生长情况并照相。
1.3酶活性的测定
采集自交和杂交后的花柱，置于1.5mL离心管中(每个处理0.2g，重复3次)，于-70℃冰箱中保存备用，用于测定花柱超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的酶活。SOD活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)光还原法，POD活性的测定利用愈创木酚法，CAT活性的测定参考愈创木酚法。
2结果与分析
2.1自花授粉后花柱SOD、POD活性的动态变化与花粉管生长的关系
自花授粉后花柱SOD活性的动态变化如图1。自花和异花授粉5h后，花柱SOD活性急骤升高，此时花粉管在花柱中均正常生长。此后，自花授粉的花柱内SOD活性逐步下降，而异花授粉的花柱内SOD酶活在10h时较低，此后逐渐上升。
自花授粉后花柱POD活性及CAT活性的动态变化如图2和图3。从图中可以看出，自花和异花授粉后花柱内POD活性在第5h后均达到最大值，此后有所降低，总体变化规律与SOD酶活基本相似。
2.2自花授粉和异花授粉后不同时间花粉管在花柱内生长的荧光显微观察
观察结果如图4。在授粉1h左右，自花授粉和异花授粉都没有花粉管延伸，柱头上也没有吸附花粉粒。大部分花粉粒在授粉后2h萌发，授粉后5h异花授粉、自花授粉的花粉管生长长度均已达整个花柱的1/5，授粉后10h异花授粉的花粉管穿过花柱1/3继续向下生长，自花授粉花粉管在此时间段内没有生长。
3讨论
花粉落在柱头上后，要经过粘附、识别、水合、萌发等过程后，花粉管才会在花柱内生长，最终直至到达子房发生双受精作用。在这个过程中，只有花粉管伸出后，才会产生对花粉的较强的束缚作用，这时即使经过碱水浸洗都很难将花粉洗脱。SOD、POD、CAT是植物体内抗氧化酶系统的重要组成部分，具有清除活性氧、催化IAA降解等重要功能。SOD能够催化O歧化生成O和HO，而过多的HO将对细胞产生毒害作用，需要POD和CAT清除，使细胞内HO处于较低水平。在授粉后5h内，自花和异花授粉后，花粉管均能够在花柱中延伸，SOD、POD与CAT的活性均快速增加，说明这段时间内，需要SOD、POD与CAT的协同作用，使花柱内HO等处于较低的水平。而在第5h后，异花授粉的花粉管能够在花柱中继续延伸，保护酶活性有所增加；而自花授粉的花粉管基本上停止生长，保护酶活性不断降低。
4结论
自交与杂交授粉后1h，在雌蕊柱头上均没有观察到黏附的花粉粒，因此，这段时间内应该没有花粉管的延伸。在授粉后的前5h内，自交与杂交系SOD、POD、CAT酶活性均快速上升，说明授粉可以显著提高保护酶系的活性，分解花柱内IAA，抑制花粉管在花柱中的生长。
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