2.3 核盘菌的侵染实验
2.3.1 核盘菌侵染植物叶片
在实验室种植的番茄、拟南芥植物，待植株长出子叶以后，将培养好的核盘菌配成浓度为每毫升50个分生孢子的悬浮液，并喷洒在新长出的健康无病的子叶上，同时在另一些番茄、拟南芥植株叶片上喷洒清水作为对照，接种后每隔一天观察并记录叶片部位的感染情况。
2.3.2 DAB和台盼蓝同时染色法
将剪成斜面的已染病的叶片叶柄，插入含有DAB溶液的20ml的大塑料试管中，使溶液浸过叶柄的斜面。光照后沿着中间的主叶脉剪切叶片，切成1.5cm的正方体小块，将其浸没于固定液中(V无水乙醇：V冰醋酸=3：1),脱去颜色后再过夜处理。叶片组织转入带盖的塑料试管中，0.3%台盼蓝溶液覆盖，本文来自辣~文\论|文/网，
毕业论文 www.751com.cn 加7位QQ324'9114找源文然后将整个试管置于热水浴（70-80℃）沸腾1分钟，叶片组织于染液浸没3-5小时。将被染色的叶片组织用水合三氯乙醛冲洗3次后再置于水合三氯乙醛中放置一段时间。
3.结果与分析
3.1 油菜菌核病病原菌的形态特征
在PDA培养基上生长的核盘菌，颜色为深褐色，表面光滑，一周左右长成菌落的形态，如图1所示。在显微镜下观察菌丝成球形或圆柱形。直径为30-63µm，如图4所示，形态特征与已报道的S.sclerotiorum基本一致，故从基本形态特征初步认定该菌为S.sclerotiorum。
图1被核盘菌侵染的油菜茎部 图2 从发病油菜茎部取到的菌核
图3 PDA培养基上生长的核盘菌 图4显微镜下的核盘菌菌丝及孢子
3.2 ITS区的扩增和测序
利用CTAB法提取油菜菌核病DNA，以提取的核盘菌菌丝DNA为模板，用引物和PCR反应体系经PCR扩增反应，分离物的病原菌丝均可扩增出600bp左右的DNA片段，与引物相符。回收PCR产物，纯化后利用ITS-PCR引物为测序引物进行序列测定，获得540 bp的扩增片段序列，如图5，用BLAST在GenBank中搜索同源序列
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