1.2 试验方法
1.2.1 引物的设计与合成
研究发现，各物种钙调蛋白都具有钙离子结合位点的共同特征，在所有真核生物中钙调蛋白都具有高度的保守性[12-13]。根据GenBank登录获取已知的稻瘟病菌、玉米大斑病菌、炭疽病菌等6种病原真菌CaM基因氨基酸序列的保守区域EFKEAFS和YNEFAQC设计的1对寡核苷酸简并引物(表1)。PCR引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
表1引物序列
N0 Oligo sequence (from 5' end to 3' end)
R
F GARTTCAAGGAGGCCTTCTC
CTGGACRAAYTCGTYGTA
1.2.2 番茄白粉病菌gDNA的提取
采用改良后的真菌gDNA提取方法提取白粉病菌的gDNA，具体方法如下：
(1) 用毛刷轻轻刷取适量受感染叶片上的菌丝于研钵中，加入与菌体粉末等体积的石英砂和适量的2% CTAB抽提液迅速研磨破碎细胞，每个EP管中分装500µL菌液。然后液氮中速冻30s，立即65℃水浴30s，反复3次，在漩涡振荡器上高速漩涡4~5min，之后于65℃水浴40min，每10min摇匀；
(2) 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25:24:1)，振荡摇匀，12000rpm离心10min；
(3) 取上清(为避免沉淀的吸入，可以再离心一次)，然后加上清液1/10体积的10% CTAB抽提液，振荡后加等体积氯仿/异戊醇(体积比24:1)，振荡混匀，12000rpm离心10min；
(4) 取上清液，加入等体积的异丙醇，轻柔混匀，-80℃放置30min后12000rpm离心15min；
(5) 弃上清，加800µL预冷的75%酒精洗涤沉淀，然后12000rpm离心5min；
(6) 弃上清，将沉淀于超净工作台上风干；
(7) 加适量无菌去离子水溶解沉淀，-20℃存放备用。
1.2.3 PCR扩增目的基因
PCR反应体系：DNA模板1μL，上下游引物各2μL，2×Taq Master Mix 10μL，加双蒸水至20μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，47℃退火45s，72℃延伸60s，37个循环；72℃再延伸5min。取样品3μL进行琼脂糖电泳，观察电泳结果。然后大量扩增并经SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。
1.2.4 pMD18-T载体与目的基因的连接反应
具体操作依据pMD18-T载体说明书进行。
1.2.5 感受态细胞的制备和目的基因的转化
操作依据分子克隆实验指南[14]。
1.2.6 重组载体的PCR鉴定
使用高纯度质粒小量快速提取试剂盒提取重组载体。分别采用重组质粒和纯水为模板进行PCR反应，所用引物及PCR条件同1.2.3。初步检测构建的重组质粒中是否含有目的基因片段。
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