甘蓝型油菜不同器官DNA提取方法的探索 第4页

.5指标测定及方法
用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测分析提取出的甘蓝型油菜DNA，并计算得出油菜不同部位如幼叶和茎的DNA纯度、浓度和产率。
1.5.1紫外-可见分光光度法
参照屈伸、刘志国的DNA纯度与浓度的紫外分光光度法测定出油菜幼叶和茎的DNA纯度和浓度[9]，具体方法如下：
首先接通电源，打开开关，紫外-可见分光光度计自动进行预热和对光路自检20min。然后取1.5μL待测DNA样品和空白对照(即TE缓冲液)分别注入不同的比色皿中，体积以比色皿容积的3/4左右即可。将比色皿放入样品槽，关闭盖板。按归零键，仪器自动校正零点。最后分别在260nm和280nm处测定DNA样品的光密度值(OD值)，待读数稳定后，每个样品重复测定3次，记录结果并计算其平均值。
计算公式如下：
(1)DNA纯度用 OD260/ OD280来表示(若OD260/ OD280接近1.8，则DNA纯度符合标准)
(2)DNA浓度(μg/mL)= OD260×50μg/mL×稀释倍数
(3)DNA产率(μg/g)= DNA浓度(μg/mL)×最终DNA体积(μL)/材料鲜重(g) 1.5.2琼脂糖凝胶电泳检测
参照屈伸、刘志国的DNA琼脂糖凝胶电泳检测出DNA样品的纯度[9]。具体方法如下：

首先要制备1%的琼脂糖凝胶液，取1g琼脂糖放入250mL锥形瓶中，加入100mL0.5×TBE缓冲液，置于微波炉上加热充分熔解。添加EB溶液至终浓度为0.5μg/mL，混匀，室温冷却至50℃左右。然后将干净、干燥的制胶板模型加好，缓慢将琼脂糖凝胶液注入1个带有“梳子”的胶床中(避免产生气泡)，约1h左
右凝胶完全凝固。凝胶凝固后，轻轻拔出梳子，将制胶板放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极(黑色电极)，注入适量的电泳缓冲液，高于胶面0.5㎝。接着取适量DNA样品，加入2μL6×加样缓冲液，反复吹吸，混匀，用移液枪缓慢将DNA样品加入加样孔中(注意吸管与加样孔垂直，并且吸管尖端恰好在加样孔开口之下)。加样结束后，正确连接电泳槽和电源,设定电压为5V/cm，打开开关，进行电泳。肉眼可见溴酚蓝泳至距制胶板前端约2-3cm处停止电泳。切断电源，取出凝胶，用凝胶成像分析系统拍照保存。
2.结果与分析
2.1甘蓝型油菜DNA的测定结果分析
提取出的油菜幼叶DNA分别编号为CTAB-1，SDS-1；提取出的油菜幼茎DNA分别编号为CTAB-2，SDS-2。分别取DNA样品20μL，各加TE缓冲液180μL，稀释10倍，混匀。以TE缓冲液为对照，分别测定DNA样品的光密度值(OD值)。DNA由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，因此DNA在波长为260nm处的紫外区有强吸收，且其吸收强度与DNA的浓度的成正比。DNA的这个物理特性为测定DNA样品浓度提供了理论基础。规定双链DNA的浓度为50μg/mL,由此可以计算DNA样品的浓度。因此，紫外分光光度法不但能确定DNA的浓度，还可通过测定OD260/OD280估测核酸的浓度。蛋白质则在280nm波长处有特异的的紫外吸收峰。纯的DNA样品的OD260/ OD280比值为1.8左右；如果比值小于1.7，则可能有蛋白质污染；如果比值高于2.0，则有可能有RNA污染。
按照下列计算公式可分别计算出提取的各组甘蓝型油菜DNA的纯度、浓度和产率。
(1)DNA纯度用 OD260/ OD280来表示(若OD260/ OD280接近1.8，则DNA纯度符合标准)
(2)DNA浓度(μg/mL)= OD260×50μg/mL×稀释倍数
(3)DNA产率(μg/g)= DNA浓度(μg/mL)×最终DNA体积(μL)/材料鲜重(g)

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