2.2 SOD粗酶提取液的制备及测定
采用NBT光还原法，称取植物材料（去叶脉）0.2g，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使体积为5ml。取2ml于1000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液，量取体积。取编号为1、2、3试管，将表中的试剂加入，测定待测样品与无酶反应液在560nm处的吸光度值[6]。不加酶提取液的三号试管溶液颜色最深，加入酶液的由于SOD抑制了NBT的光还原，溶液颜色变浅。
表1 SOD活力测定加样表
试剂（酶） 1 2 3
反应介质/ml 3.9 3.9 3.9
酶提取液/ml 0.1 0.1 0
50mol/L磷酸缓冲液/ML 0 0 0.1
备注 待测样品 空白 无酶反应液
2.3 POD粗酶提取液的制备与测定
采用愈创木酚，称取5g洗净的新鲜叶片，切碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨、成均浆液，将均浆液全部倒入离心管中，得到的上清液并入容量瓶中，定容至至刻度，低温保存。取两支试管，均加入0.05mol/L磷酸缓冲液2.9mL，2%H2O21ml和0.05mol/L愈创木酚0.05ml，然后在另一个试管中加入0.05ml在沸水中加热煮沸5min的酶液（作为对照）[7]。立即于37℃水浴中保温15min，然后迅速转入冰浴中，并加入20%三氯乙酸2ml终止应。在12000r/min离心10min，收集上清液并适当稀释，此时制备的上清液即为POD 上清液。 表2 POD活力测定加样表
反应物 对照 样品
磷酸缓冲液/ML 3.0 2.9
愈创木酚/ML 0.05 0.05
酶液/ ML 0 0.1
在470nm处测OD值，读出第2分钟，第3分钟的OD值。
2.4丙二醛含量测定
采用直线方程法，称取剪碎的试材1g，加入2ml 10％TCA和石英砂，研成匀浆，再加8ml TCA进一步研磨，匀成的浆离心（4000×g）10min，丙二醛提取液为上清液。显色反应和测定，吸取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml 0.6%TBA溶液，混合物在沸水浴上需反应15min，冷却后再离心[8]。测定上清液在532nm、600nm和450nm波长下的消光度[9]。按MDA在532nm的毫摩尔消光系数为155求出提取液中MDA浓度。公式如下：
2.5脯氨酸含量的测定
取不同处理的撕碎搅匀叶片0.2-0.5g，添加5ml 3%磺基水杨酸溶液，试管口盖上玻璃球，沸水浴中浸10min。拿出试管使冷却到室温后，吸上清液2ml，添加3ml显色液和2ml冰乙酸，在沸水浴中加热40min，然后操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色[10]。
2.5.1标准曲线的绘制
（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100μg。
（2）浓度配制：取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1、2、3、4、5及6 μg/ ml。
（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。
（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，色素全部转入甲苯溶液中。
（5）每个管上层脯氨酸甲苯溶液使用移液器轻轻吸取至比色杯中，在520nm波长处甲苯溶液作为空白对照组，本文来自辣)文^论(文/网，毕业论文 www.751com.cn 加7位QQ324-9114找源文进行比色。
（6）绘制标准曲线：先求出吸光度值依脯氨酸浓度而变的回归方程式，计算2ml提取液中脯氨酸的含量（μg/2ml）[11]。
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