粗毛栓菌Mnp的分离与纯化+开题报告 第3页
菌株及培养方式
1.2.1 菌株
白腐担子菌粗毛栓菌系孙迅博士于1997年8月在山东省荷泽市北郊的护城堤上，从被砍伐的杨树上分离得到的。 同年山东省科学院生物研究所微生物分类室的马启明先生对其进行初步鉴定，定名为Trametes gallica Fr.［2］。
1.2.2 培养基
无机盐液（g/L）:KH2PO4 ,1g;MgSO4 ,0.5g;(NH4)2SO4 ,3g
微量元素母液（2mL）： MnSO4•H2O,0.0784mg；NaCl，0.14mg；FeSO4•7H2O,0.014mg；CoCl2•6H2O,0.026mg；ZnSO4•7H2O,0.0014mg； CuSO4•5H20,0.02184mg；KAl(SO4)2 •12H2O 0.0014mg；H3BO4,0.0014mg；Na2MoO4•2H2O,0.0014mg；CH3COOCl，0.021mg [3]
1．2.3原酶液的来源
已在本实验室培养近60天的粗毛栓菌，生长于袋装麦草粉上，每袋内含过10木筛的风干杨木锯末500g以及1.5Kg无机盐水溶液，共三袋
1.3 锰过氧化物酶的分离与纯化步骤
1.3.1 粗酶液的制备
把培养60d的菌丝体用辣层纱布过滤，弃去菌体，留取滤液，共获得1500mL粗酶液。
1.3.2 硫酸铵盐析
向粗酶液中加入固体硫酸铵粉末，使其成为30%饱和度（每100mL加16.4g硫酸铵），并缓慢搅拌，使硫酸铵完全溶解，于4℃静置过夜，离心（6000r/min，4℃）15min，除去沉淀物,留取上清液；然后将上清液硫酸铵饱和度上调至75%（每100mL加28.5g硫酸铵），再于4℃静置过夜，离心（7500r/min，4℃）20min，弃上清，留取沉淀；用少量蒸馏水溶解沉淀[4]。
1.3.3 透析
将酶沉淀装入透析袋（截留分子量为12-14 kDa）中放入预冷的蒸馏水中于4ºC进行透析，每隔2小时换一次蒸馏水，直至酶中不存在硫酸根离子。
1.3.4 Q-Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析
用阴离子交换剂Q-Sepharose Fast flow 装制成一根1.6×20cm柱，连接梯度混合器、恒流泵、核酸-蛋白检测仪和自动部分收集器。
柱的装填：把层析柱固定在架子上，层析柱必须与地面垂直，否则装好的柱床表面倾斜，影响层析分离的效果。装柱时，离子交换剂要分几次加入。如果待第一次离子交换剂在柱中沉淀到十分紧密后，再加入第二批时，两者之间就会产生明显得节痕。在发生上述情况时，可在加第二批之前，先用玻璃棒轻轻搅动第一次沉积的柱床的表面，使其疏松并有部分的悬浮，然后再加入第二批悬浮液。层析柱装好后，用胶头滴管慢慢的吸取柱床上面的溶液。上样前预先用去离子水平衡，再用20mmol/L的NaAc-HAc缓冲液（PH5.5）平衡交换柱，平衡液体积为柱床体积的3-5倍，直至流出液的pH接近5.5。
加样和洗脱：用恒流泵将透析后的原酶液以1.5ml/min的速度加样于交换柱，上样完毕后，用同样的缓冲液（即20mmol/L的NaAC-HAc pH5.5）洗柱。此时的流出液用烧杯收集。大约5h后，待OD280光吸收峰回到基线，用200ml NaAc-HAc (20mmol/L pH5.5)缓冲液和由此缓冲液配制的200ml的0.4mol/L的NaCl对离子交换柱进行洗脱（梯度溶液由梯度混合器获得，NaCl溶液的浓度由低到高）[5]。 洗脱速度为1.5mL/min,用自动部分收集器收集流出液，每3min收集一管，共收集160管。测定流出液的酶活性，合并具有同样酶活性的流出液。
1.3.5 MnP酶活力的测定
锰过氧化物酶（Manganese (II) peroxidases, MnPs, EC 1.11.1.13）活力的测定：采用Michael的方法[7]。反应混合液含有0.1 mol/L乳酸钠缓冲液（pH 4.5），0.1 mmol/L MnSO4•H2O和0.1 mmol/L H2O2。反应由加入H2O2而启动[8]。测定反应前1 min内在240nm处吸光值的增加，定义每分钟使1μmol/L Mn2+氧化成Mn3+所需的酶量作为1个酶活力单位（U）。乳酸与Mn3+所形成的络合物的摩尔消光系数为6,500 M-1 cm-1。
锰过氧化物酶酶活力计算公式如下：
U/L ＝ n × ΔA × 106 / 6,500
其中，n为酶液稀释倍数，ΔA为反应液在1 min内于240nm处吸光值的变化值[9]。
1.3.6蛋白质含量测定
采用考马斯亮蓝G-250比色法：此法为染料结合法[10]。
以牛血清白蛋白（BSA）为标准液绘制标准曲线[11]。按下面表格中数据加入试剂：
试管编号
操作 空白 标准蛋白质浓度梯度 样品
0 1 2 3 4 5 Ⅰ Ⅱ Ⅲ
BSA标准液（mL） -- 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 -- -- --
样品待测液（mL） -- -- -- -- -- -- 1.0 1.0 1.0
蒸馏水（mL） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 -- -- --
考马斯亮蓝染液 各5.0mL
反应 各管混均，室温下放置5min。
比色 以0号管为空白参比，测定λ=595nm处的吸光度。
1.3.7 浓缩
将具有酶活性的流出液收集，然后收集液（51mL）用移液枪注入到透析袋中,用聚乙二醇（20000）进行浓缩。浓缩到一定程度，将浓缩后的锰过氧化物酶于-20℃冰箱中备用。
2 结果与分析
2.1 MnP的柱层析纯化结果
结果显示：在150个试管中,只有很少的几个试管能够测到没活,并且这几个试管的编号不是连在一起的,而其他的测不到酶活,也就是说,通过离子交换层析(Q-Sepharose Fast flow),没有能够得到具有锰过氧化物酶(MnP)活性的组分。
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