Seperation and Purification of Laccases in Trametes gallica
Student majoring in Biotechnology Ding Jijin
Tutor Sun Xun
Abstract:The crude enzyme was ultrafiltrated,salted out,dialyzed concentrate and ap-plied to Q-Sepharose ion exchange column.The composition with laccase activity was abtained.
Key words: Trametes gallica Fr., laccase, ion exchange chromatography
引言
漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，最早是从日本的漆树汁中发现的，是人类最早发现的酶之一，但直到现在，人们对它的认识还不完整[1]。近年来，随着漆酶功能的逐步发现，有关漆酶的研究受到普遍的重视。由于在降解木质素方面的功能，使之在制浆造纸工业，特别是纸浆生物漂白领域得到深入的研究和开发[2，3]，在环保方面也有很大的潜力，如它可与有毒的酚类作用，使含苯氧基类的除草剂、石油化工废物的物质解去毒性等[4]。
随着应用的不断加深，漆酶的研究和开发越来越受到人们的关注[5]。对白腐真菌粗毛栓菌( Trametes gallica Fr.) 的前期研究显示,该菌能产生3 种主要的木质素降解酶:木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase) ,锰过氧化物酶(Manganese Peroxidase) 以及漆酶,且具有较好的木质素降解能力[6]。通过对测定真菌漆酶酶活的各种不同的分光光度法进行了综述和比较分析,认为采用ABTS法作为测定漆酶酶活的方法较具合理性和科学性,建议作为漆酶酶活测定
的统一方法[7]。本文就以漆酶的分离、纯化及其部分性质进行初步研究。并测定其纯化度和回收率。
1 材料与方法
1.1 材料来源
粗酶液是由孙迅老师提供。该酶液来自粗毛栓菌Trametes gallica Fr.在麦草粉中的培养物[8]。
1.2 方法
1.2.1 硫酸铵盐析 首先在粗酶液中添加固体（NH4）2SO4粉末至30%饱和度，过夜离心（7,000r/min，4℃ ）20 min,除去部分杂蛋白沉淀物；然后将上清液上调到75%饱和度，于4℃静置过夜。
1.2.2 离心 离心（7,500r/min，4℃）20 min，弃去上清夜，用适量去离子水溶解沉淀。
1.2.3 透析 将溶解物装入透析袋（截留分子量为12-14 kDa）内,用去离子水进行透析,2-3小时更换一次蒸馏水,更换3-4次。
1.2.4 酶活力和蛋白含量的测定 将透析后的酶液倒入烧杯中，得476mL酶液。测定漆酶的总酶活和酶液的总蛋白含量。
1.2.4.1 酶活力的测定 ABTS是测定漆酶酶活常用的底物,底物在漆酶催化作用下首先形成底物自由基,底物自由基在特定的光波波长下有最大的吸光原文请找腾讯752018766辣,文-论'文.网http://www.751com.cn 处的吸光值。漆酶酶活力计算公式 U/L=n×ΔA×106/23,300×3 (ΔA代表吸光值；n代表稀释倍数；n=250;233,300为在420nm处的摩尔消光系数[10])
1.2.4.2 蛋白含量的测定 在3ml的考马斯亮蓝中加入50ul的酶液。在A595下测定光吸收值。查标准曲线，得出酶液中蛋白质的含量[11]。
1.2.5 酶液浓缩 用聚乙二醇浓缩酶液，使酶液中多余的水被吸出。使酶液呈浓缩状态，得40mL酶浓缩液。
1.2.6 离子交换柱层析 首先用阴离子交换剂Sepharose-Q Fast Flow装制成一根1.6×20 cm柱，连接核酸-蛋白紫外检测仪和自动部分收集器。上样前预先用200ml(20mmol/L)乙酸钠缓冲液（pH 5.0）平衡交换柱，取2mL的酶浓缩液稀释
到40mL上样。上样后用含有0.1～0.5mol/L NaCl的缓冲液（pH4.5）进行梯度洗
脱，每一试管收集5mL洗脱液。
1.2.7 酶活力和蛋白含量的测定 用上述方法测定每一试管漆酶的活性，将集有活性的洗脱液混合，测定回收后漆酶的总酶活和酶液的总蛋白含量。
1.2.8 酶回收率及纯化度的计算 回收率= U1/U2（U1:层析后总酶活力 ；U2:层析前的总酶活力），纯化度=N1/N2 (N1：层析后的比活力；N2：层析前的比活力）
2 结果与讨论
2.1 牛血清蛋白曲线
牛血清蛋白浓度与光密度值的关系见表1。
表1.牛血清蛋白浓度与光密度值值的关系
BSA浓度(μg/mL） 20 40 60 80 100
光密度值（OD595nm） 0.265 0.483 0.765 0.932 1.036
得到标准曲线的回归方程为：A=0.009955x+0.0989，结果表明，牛血清白蛋白量在0—1mg/mL范围内与光密度值线性关系良好，并绘制图1如下。
图1.牛血清蛋白标准曲线
2.2 离子交换柱层析结果
离子交换柱剂虽然能对漆酶进行静止吸附，但由于发酵液中存在大量的色素，使洗脱下来的漆酶液呈深黄褐色液体，影响了漆酶的活性，为了得到更为纯
化的漆酶，用Q-Sepharose可获得较好的分离效果。收集有酶活性的部分，即得部分纯化的组分[11]。
表2.洗脱组分漆酶活力测定结果
试管号 光吸收值（A）
Absorbance 酶活力 (U/L)
Enzyme activity 试管号 光吸收值（A）
Absorbance 酶活力 (U/L)
Enzyme activity
29 0.021 676.0 45 0.184 5922.7
30 0.062 1995.7 48 0.133 4281.1
31 0.102 3283.3 51 0.127 4088.0
32 0.121 3894.8 54 0.120 3862.7
33 0.278 8948.5 57 0.245 7886.3
34 0.454 14613.7 60 0.073 2349.8
35 2.487 80053.6 63 0.107 3444.2
36 2.080 66952.8 66 0.064 2060.1
37 1.609 51791.8 69 0.060 1931.3
38 0.971 31255.4 72 0.059 1899.1
39 0.627 20183.4 75 0.036 1158.8
40 0.496 15965.7 78 0.062 1995.7
41 0.373 12006.4 81 0.074 2382.0
42 0.282 9077.3 90 0.081 2607.3
43 0.237 7628.8 93 0.062 1995.7
44 0.184 5922.7
注：由图示知酶活性主要集中在31到57管之间。
以洗脱体积为横坐标，以三分钟求得的酶活力值做纵坐标，绘制洗脱曲线如下：