粗毛栓菌产果胶酶初步研究+产酶曲线+酶性质研究 第3页
材料与方法
1.1 菌株
白腐担子菌粗毛栓菌是山东省菏泽学院生命科学系教授孙迅博士于1997年8月在菏泽市北郊的护城堤上，从被砍伐的杨树上分离得到的。该野生菌株于同年经山东省科学院生物研究所微生物分类室的马启明先生对其进行了初步鉴定，定名为Trametes gallica [3](如下图)：
粗毛栓菌（Trametes gallica）在麦草上长出的子实体（来源于菏泽学院分子实验室）
1.2 主要仪器和试剂：
研究中所用的主要仪器和试剂有: 生化培养箱HPS-160(哈尔滨东联电子技术公司), PHS-3C精密酸度计（上海康议仪器有限公司），HZQ-C空气浴振荡器（哈尔滨东联技术开发中心），恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂），FA2004A分析电子天平（上海精天电子仪器有限公司），立体自动电热压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂），DYCZ-28D型电泳槽（北京辣一仪器厂），冰箱， 锥形瓶, 碱式滴定管，铁架台，碘量瓶，移液枪，移液管，离心管, 透析袋，果胶，酵母粉，琼脂等
1.3 培养基
PDA培养基[4]（即马铃薯葡萄糖培养基，活化培养基），配方是马铃薯200g,蔗糖（或者葡萄糖）20g，琼脂15-20g,水1000mL,pH自然，具体方法是：马铃薯去皮，切成块，煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000mL，121℃灭菌30min。此培养基用于活化粗毛栓菌。
产果胶酶培养基[5]（液体培养基，第一次配制210mL,第二次配制1000ml）：果胶（1%）；(NH4)2SO4 (0.5%); KH2PO4(0.25%); MgSO4•7H2O (0.05%); NaNO3(0.02%); 微量元素（500×）（0.1%） 0.2mL。配制成210mL，分装于七个锥形瓶中，第二次配制1000mL,分装于三较大的锥形瓶里。
微量元素母液（mg/L）:CaCl2•H2O 700; MnSO4•H2O 500; FeSO4•7H2O 500; CuSO4•5H2O 600; ZnSO4•7H2O 200; H3BO3 200; NaMoO4•2H2O 200; CoCl•6H2O 100。使用时，取2mL母液加入1000mL水中即可。
该产果胶酶培养基是以果胶作为唯一碳源的选择培养基，以该培养基培养粗毛栓菌，主要目的是使该菌产生大量的果胶酶，在绘制出粗毛栓菌产果胶酶的产酶曲线的同时，提取粗酶液对粗毛栓菌所产的果胶酶进行性质分析，包括最适作用温度、最适作用pH及激活剂、抑制剂。
1.4 实验操作技术路线
活化培养基（PDA培养基）配制→分装，灭菌（121℃，30min）→接种→活化培养（26℃, 5-7天）→接种→培养（26℃,200r/min）→取培养液（培养三天后开始取）→离心（6000rpm,5min）→取上清，弃沉淀→酶性质分析
1.5 研究方法
1.5.1 粗酶液制备[6]：
取培养三天的培养物10mL，离心（6000rpm，5min），取上清，此即为测酶活所用的粗酶液。
1.5.2粗毛栓菌果胶酶酶活测定方法
碘量法[7]：取1%果胶溶液原文请找腾讯752018766辣,文-论'文"网
http://www.751com.cn 碘液4mL，摇匀，加塞，于暗处放置20min，加2N硫酸2mL，用0.05N硫代硫酸钠滴定至浅黄色 ，加0.5%淀粉指示剂1mL，继续滴定至蓝色消失。记录所消耗的硫代硫酸钠的毫升数（A）。空白试验加4mL果胶溶液、2mL缓冲液、煮沸失活的酶液2ml，滴定，记录所消耗的硫代硫酸钠的毫升数（B）。在上述条件下，每小时酶促催化果胶分解生成1mg当量游离半乳糖醛酸定为一个酶活力单位
果胶酶活力=（B-A）N*0.51/5*2*5
式中：B为空白消耗硫代硫酸钠的毫升数，A为试样消耗硫代硫酸钠毫升数 ，5为吸取反应液毫升数，2为反应时间，5为酶液毫升数，0.51为1mg当量硫代硫酸钠相当于0.51mg当量游离半乳糖醛酸，N为硫代硫酸钠当量数。
1.5.3 温度对酶活的影响：在pH5.0、反映1h的条件下，分别测定在不同温度下酶促反应的酶活，作温度-相对酶活曲线。
1.5.4 pH对果胶酶活性的影响：在40℃、反应1h条件下，分别测定在不同pH值时的酶活，作pH-相对酶活曲线。
1.5.5 金属离子对果胶酶酶活性的影响：将不同金属离子溶液与酶液混合，金属离子终浓度为2mg/100mL，40℃反应1h，按滴定法测残余酶活，以不加金属离子的酶液作对照。
1.5.6 产酶曲线的绘制:在 40℃ pH 5.0条件下，反应1h,分别测定不同时期的酶活，对照组加等量失活酶液。
2 结果与分析
2.1温度对酶活的影响
由图1可以看出温度对酶活的影响较大，在实验条件下，果胶酶的最适作用温度为40℃。
图1 酶的的最适作用温度曲线
2.2 pH值对酶活性的影响
在40℃、反应1h条件下，分别测定在不同pH值时的酶活，做pH-酶活曲线，图2显示不同pH测定结果，在40℃果胶酶在pH5.0表现出最大活性。
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