粗毛栓菌木聚糖酶cDNA的RT-PCR扩增+开题报告 第3页
主要仪器、试剂与材料
1.1 主要仪器、试剂
研究中的主要仪器有：高压蒸汽灭菌锅，震荡培养箱，生化培养箱HPS-160（哈尔滨东联电子技术公司），SZ-1型快速混匀器(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)，5417-R型Eppendorf 离心机（德国），电泳仪DYY–8C型（北京辣一仪器厂），电泳槽：DYY–错误！未找到引用源。–31A型（北京辣一仪器厂），TP600梯度PCR仪（日本TaKaRa公司），100mL玻璃研磨器，FR-200紫外与可见分析装置（上海复日科技有限公司），EP管，移液枪。
研究中的主要试剂有：半纤文素，酵母粉，微量元素，氯仿-苯酚混合物，异丙醇, 乙酸铵， 75%冰冷乙醇， 37%甲醛，溴乙锭（0.5g/mL）， 酒石酸铵，Mg2SO4•7H2O，10×PBS[9]（Na2HPO4 11.5g， KH2PO4 2g， NaCl 80g， KCl 2g溶于1L灭菌去离子水中，1×PBS的pH为7.4），DEPC水, 柠檬酸饱和酚，酚氯仿异戊醇混合物（25:24 :1)，异硫氰酸胍，5×甲醛胶缓冲液[9]{ 0.1mol / L MOPS [ 3—(morpholino) propanesulfonic acid ] pH7.0；40 mmol ∕ L 乙酸钠；5mmol ∕ L EDTA , pH8.0}，细胞裂解液{内含CBS(柠檬酸/SDS/ β-巯基乙醇)}，EDTA；6×上样缓冲液，10×上样缓冲液，琼脂糖，反转录试剂盒（日本Takara公司）；PCR扩增试剂盒（日本Takara公司），TAE缓冲液，250bp-DNA-Ladder-Marker（日本Takara公司）等。
1.2 材料
白腐担子菌粗毛栓菌系菏泽学院孙迅博士于1997年8月在山东省菏泽市北郊的护城堤上，从被砍伐的杨树上分离得到的。该野生菌株于同年经由山东省科学院生物研究所微生物分类室的马启明先生对其进行了初步鉴定，定名为Trametes gallic[3]，图1.1[4]。孙迅博士对木聚糖酶进行酶谱分析时发现在木聚糖底物胶上能够看到2条透明带，表明在原原文请找腾讯752018766辣,文^论'文.网
http://www.751com.cn 酶样品中可能至少存在2种木聚糖酶。
图1 粗毛栓菌（Trametes gallica）在麦草上长出的的子实体[4]
PCR引物
序号 序 列 编 号 序 列 用 途 碱基
个数
1 Primer F 5’-atg ttc ccc a(g)ca(c) gt(c)c t(g)cc ct-3’ 上游引物 20
2 Primer R1 5’-cta caa gaa cgc ctt ga-3’ 下游引物 17
3 Primer R2 5’-tc(t)a ga(t)a c(g)gt cga gcc g(a)at-3’ 下游引物 182方法
2.1 菌种的的培养
2.1.1 培养基的配制
PDA培养基：去皮土豆200g(加水煮沸20min,冷却至室温纱布过滤的滤液）；葡萄糖20g;琼脂粉15g;补水至1000mL。
浅层静置培养基：半纤文素:3g；酒石酸铵:15mg；Mg2SO4•7H2O:150mg；KH2PO40.15g；酵母粉30mg；100×微量元素母液0.3mL（pH6.5），共五瓶（30mL/瓶），灭菌（121℃、30min）。
2.1.2 菌种的接种
取米粒大小的粗毛栓菌菌丝体块保存菌种快速接种到PDA 固体培养基上。接种完毕后重新将培养基锥形瓶封口。28.7℃培养一周，用于菌种的活化。按上述操作将活化的菌种接种到浅层静置培养基上，28.7℃培养 9-12天，待其褐变后用于总RNA的提取。
2.2 RNA的提取
2.2.1 实验前的准备
对有关器皿及试剂的处理，按照有关文献所述进行[9]。
2.2.2 提取RNA
1 样品的准备
取出在28.7℃恒温培养9-12天的粗毛栓菌培养基，经过四层纱布过滤获取其中的粗毛栓菌菌丝，然后用已预冷的PBS洗净并置于无菌的多层 “新华1号”滤纸之间，吸干多余的液体。
2 RNA的抽提
用灭菌牙签迅速将菌丝体(大约0.4g)转移至已经DEPC处理过的20 mL玻璃研磨器中，加入6 mL预冷的RNA抽提裂解变性液{25g异硫酸氰胍，溶于33mLCBS缓冲液}，研磨，直至研磨液呈均匀的浆液状。加入0.5 mL 2 mol/L 的HAc-NaAc（pH 4.0）缓冲液，混合均匀。将研磨液转移至10只用DEPC处理过的1.5mL EP管中，向每只管中加入与样品等体积的（约0.6mL）酚氯仿异戊醇混合液（酚氯仿异戊醇 = 25∶24∶1），混匀，强力振荡（涡旋）20 sec，然后静置冰原文请找腾讯752018766辣,文^论'文.网
http://www.751com.cn 中加入与样品等体积的氯仿，离心（10000rpm，4℃，10-15min），取出上层水相至另外2只经DEPC处理过的1.5mL EP管中，向每只管中加入与样品等体积的冰冷的异丙醇，上下反转几次（混匀），-20℃冷冻10-20min，离心（10000rpm，4℃，15min），弃去上清夜，再向每管中分别加入0.5mL 75%的乙醇，离心（10000rpm，4℃，15min），弃净乙醇，室温下开盖静置5-10min，加100µL DEPC水，并于-20℃下保存，备用
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