粗毛栓菌木聚糖酶cDNA的RT-PCR扩增+开题报告 第4页

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总RNA的纯度与浓度的测定
取25μL上述总RNA的提取液和2.5mL去离子水，放入石英比色皿中，混匀，分别在260nm和280nm波长下，用分光光度计测量其光吸收值，通过计算A260 和A 280的比值测其纯度；并根据以下公式计算总RNA的浓度和提取量。
总RNA样品的浓度（μg/μL）=OD260 ×核酸稀释的倍数×40÷1000。
2.4  总RNA的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测
采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳对总RNA进行检测[2]。称取0.4 g琼脂糖于24.8 mL灭菌水中，加热融化，冷却至50℃后加入8mL 5×甲醛胶缓冲液{0.1 mol/L MOPS [3-（morpholino） propanesulfonic acid], pH 7.0；40 mmol/L乙酸钠；5 mmol/L EDTA，pH 8.0}和7.2 mL 37%甲醛，混匀冷却至约60℃时倒入制胶槽中，使凝固。取30L RNA样品与13.3 L 5×甲醛胶电泳缓冲液、23.3L 37%甲醛和66.7L 10mol/L的尿素混合，65℃，保温15 min，于冰浴中速冷，加入10L 6×上样缓冲液，混匀，立即上样（凝胶已预电泳5 min，每个点样孔20L，共2道），点样孔两边分别点一到9L1×甲醛胶电泳缓冲液和1L6×上样缓冲液的混合物，在1×甲醛胶电泳缓冲液中恒压（5 V/cm）电泳，待溴酚蓝染料到达凝胶底部约1/4处时，停止电泳，将凝胶浸入含溴乙锭（0.5 g/mL）的去离子水溶液中染色30 min，然后放入去离子水中漂洗3-5min。最后用FR-200紫外与可见分析装置显像并拍照。
2.5  RT-PCR
2.5.1 RT-PCR过程
利用日本Takara公司生产的反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒进行逆转录。在0.5mL EP管中加入10xOne Step PR-PCR Buffer  10L，One Step Enhancer Solution  2L，dNTP Mixture (10meach)  4L，RNase Inhibitor (40U/L) 2 L，
Prime ScriptTM RTase (for one Step)  1L，TaKaKa EX TaqTMHS (5U/ L)  2 L，上游特异引物（20µM）2 L，下游特异引物（20µM）2 L，试验样品20L，无RNase水至100L，混匀后，于干式恒温器中50℃保温30min，冰上速冷，再用70℃保温5min。将混合物平均分装到4个0.5mLEP管中，并编号①~④。  将4个0.5mLEP管，放入梯度PCR扩增仪中，温度分别是49℃、52℃、55℃、58℃进行PCR反应，条件如下：94℃ 5min（预变性）；94℃ 30sec，退火30sec，72℃ 1 min，（30个循环）；72℃ 3min。
2.5.2 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
     PCR反应结束后，称取0.5g琼脂糖于50 mL 0.5 × TAE缓冲液中，加热融化，待不汤时倒入胶槽中，冷却，凝固。分别向①~④EP管（每管22.5μL）中的加入2.5 μL 10x上样缓冲液，混匀，立即将样品上样于已预电泳5 min的加样孔中，每个样孔加样10μL，DNA marker样10μL同时上样于样品道旁边，另一边加9μL电泳缓冲液与1μL上样缓冲液的混合物，恒压（110V）电泳。待染料到达凝胶底部约1/4处时，停止电泳，将凝胶浸入溴乙锭（0.5 μg/mL）溶液中染色30 min，然后用去离子水漂洗3min-5min。最后用FR-200紫外与可见分析装置显像。
                            
3  结果与分析
3.1  总RNA电泳结果
mRNA的质量（原文请找腾讯752018766辣,文^论'文.网http://www.751com.cn 分子的完整性和纯度）在随后的反转录反应中，是决定能否获得全长cDNA的关键因素之一，在细胞内，RNA主要由以下几类分子组成：rRNA（占RNA总量的80%～85%）、tRNA和核内小分子RNA（占10%～15%）、mRNA（占1%～5%）。根据沉降系数，真菌的rRNA一般可以分为25S（在高等动植物，一般为28S）、18S和5.8S等几类。由于rRNA在总RNA中含量多而种类少，所以根据它们的密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳或离子交换层析就可以将它们分离[5]。尽管mRNA分子种类繁多，但是其含量少，分子量大小也很不均一，所以在电泳图谱上，往往呈微弱的弥散形分布。对新制备的总RNA中mRNA质量的检测，通常是依赖凝胶电泳技术，通过对rRNA质量的判断而确定的。高质量的总RNA制备物的电泳图谱应当是，28S rRNA和18S rRNA的带形整齐，且无脱尾或弥散现象；有时，28S rRNA带的亮度可达到18S rRNA的2倍。在总RNA的制备过程中，如果由于操作不当或由于RNase的污染而造成28S rRNA和18S rRNA部分降解，那么，在电泳图谱上，它们的带形就会出现严重拖尾或弥散现象，甚至不成带形，一旦出现这种情况，就说明mRNA的质量也已经没有保证了，即不能用于RT-PCR、Northern印迹和分子杂交等研究工作了。因为在总RNA中，mRNA应当是伴随着28S rRNA和18S rRNA的降解而降解的，尤其是由于RNase引起的降解作用更是如此[4]。
电泳结果不明显，没有图像，只看到空白的胶

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