粗毛栓菌木聚糖酶的初步分离与纯化+开题报告+任务书 第3页

粗毛栓菌木聚糖酶的初步分离与纯化+开题报告+任务书 第3页
溶液的配制
1.1.3.1  3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂
    甲液：称取10g NaOH，用去离子水溶解，定容至200mL，将其分为50mL和150mL两部分，在50mL NaOH溶液中加入2g苯酚，在150mL NaOH溶液中加入10g DNS，加热溶解。乙液：称取300g酒石酸钾钠溶于500mL水中，加热溶解。待甲、乙两种溶液冷却后，合并、混匀，并加入0.5g亚硫酸氢钠，搅拌、混匀，定容至1000mL。
1.1.3.2  0.2mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液（pH 5.0）
称取34.45g无水醋酸原文请找腾讯752018766辣,文-论'文~网http://www.751com.cn 钠，用去离子水溶解。并量取10.29mL冰醋酸，最终定容至3L，用pH计调至pH 5.0。
1.1.3.3  1%燕麦木聚糖溶液
称取1g桦木木聚糖，加入少量pH5.0的醋酸钠-醋酸缓冲液，加热、搅拌溶解，冷却后用同样的缓冲液定容至100mL，4℃冰箱保存。
1.1.3.4  考马斯亮蓝G-250溶液
称取10mg考马斯亮蓝G-250，溶解于5mL 95%无水乙醇中，加入10mL 85%磷酸，去离子水定容至100mL。
1.1.4菌株
粗毛栓菌（Trametes gallica Fr．），孙迅博士分离自菏泽市郊护城堤一杨树桩上，已初步鉴定，现保存于菏泽学院分子生物学实验室[5]。
1.2  试验方法
1.2.1 木糖标准曲线的制作
准确称取干燥至恒重的木糖标准品4mg，用4mL蒸馏水溶解。按下表数据在各管中加入各种试剂：
 空白 1 2 3 4 5
含糖总量（mg） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
木糖溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0
DNS试剂（ml） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
试剂加完后混匀各管，沸水浴5min，冷却至室温，分别用去离子水将各管定容至25mL，混匀。选用光程1cm的比色杯在550nm处比色，用空白管作对照，测各管光密度值，每管重复三次，求平均值。以木糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线[6]。
1.2.2硫酸铵盐析
向经超滤浓缩的粗酶液中原文请找腾讯752018766辣,文-论'文~网http://www.751com.cn 添加固体(NH4)2SO4至30%饱和度，4℃过夜，离心（6000r/min，4℃）15min，除去杂蛋白沉淀物；然后将上清液中硫酸铵饱和度上调至75%，再于4℃静置过夜，离心（7500r/min，4℃）10min，弃上清，将沉淀于-4℃冰箱中保存，备用。
1.2.3 Sephadex G-150分子筛层析
将用醋酸钠缓冲液（pH 5.0）处理好的Sephadex G-150装制成1.6×115cm柱，连接核酸—蛋白紫外检测仪和自动部分收集器。上样前用上述缓冲液平衡柱，浓缩样品的上样量不大于5mL。洗脱线速度为6cm/h，每管收集2mL。检测流出液的酶活性，合并具有相同酶活性的组分，用75%饱和度的(NH4)2SO4盐析流出液，离心（4℃，7500r/min）20min，收集沉淀，用少量去离子水溶解沉淀，再对去离子水进行透析[7]。透析液可用聚乙二醇（平均分子量＞20000）进一步浓缩。
1.2.4木聚糖酶[β-(1→4)D–Xylanase]活力测定
采用DNS（dinitrosalicylic acid）法即3，5–二硝基水杨酸法[8,9]。取0.9 mL由50mmol/L NaAc-HAc（pH5.0）缓冲液配制的1%桦木木聚糖于25mL刻度试管中，加入0.1mL适当稀释的酶液，于45℃水浴中保温30min后，加入3mL 1% DNS试剂，混匀，在沸水浴中煮15min，冷却至室温，补加水至25mL，混匀，于550nm处测定吸光值。以每分钟催化木聚糖水解生成1mol木糖所需的酶量定为1个活力单位。
木聚糖酶酶活力计算公式如下：
木聚糖酶酶活力（U min-1 mL-1）＝ nA /（150.13 × 30）
其中，n为酶液稀释倍数，A为经木糖标准曲线上吸光值计算所得的木糖微克数，150.13为木糖分子量，30为酶作用时间（min）。
1.2.5蛋白含量的测定
参照Bradford[10]法：取一系列试管，分别加入0，0.2， 0.4，0.6，0.8，1.0 mL的标准牛血清白蛋白溶液(100g/mL)，然后向每试管中分别加入考马斯亮蓝G-250（0.01%）5mL，最后用水补充至6 mL，混匀，室温静置2min，选用光程为1cm的比色杯，以不加牛血清白蛋白(BSA)的试管为对照，在595nm处比色。以牛血清白蛋白的浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。取待测样品溶液1mL，加入考马斯亮蓝G-250 5mL，混匀，按上述方法测定595nm的光密度值。平行做3份。比色后，从标准曲线上查出待测样品的蛋白质浓度。
1.2.6粗毛栓菌木聚糖酶的电泳法制备
1.2.6.1活性-聚丙烯酰胺凝胶电泳 
活性-聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）[7,11]用于木聚糖酶的回收制备及活性检测，样品为经过层析法分离的部分纯化的酶样品。
8%分离胶（20mL）：含有5.3mL 30%凝胶储备液（含29%丙烯酰胺和1% N,N’-亚甲双丙烯酰胺）、2.5mL 3.0mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.9）、0.1mL 10% TEMED、0.2mL 10%过硫酸铵、11.9mL dH2O．
5%浓缩胶（10mL）原文请找腾讯752018766辣,文-论'文~网http://www.751com.cn ：含有1.7mL 30%凝胶储备液、2.5mL 0.5mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 6.7）、0.05mL 10% TEMED、0.1mL 10%过硫酸铵、5.65mL dH2O。

上一页  [1] [2] [3] [4] 下一页

粗毛栓菌木聚糖酶的初步分离与纯化+开题报告+任务书 第3页下载如图片无法显示或论文不完整，请联系qq752018766