粗毛栓菌木聚糖酶的初步分离与纯化+开题报告+任务书 第4页

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将垂直板电泳槽、电泳板、梳子等刷洗好，烘干后组装、封槽(1.5％的琼脂封槽，即1.5g的琼脂溶于100ml pH8.3的Tris-Gly电极缓冲液)。将分离胶混匀倒入电泳槽的玻璃板间隙中（胶液高度约为玻璃板纵长2／3），并加少量dH2O封面，聚合20-30min，待其聚合后，用吸水纸将其上层的dH2O吸去。将制备的浓缩胶加于分离胶上面的空隙中，在胶层上面留有1-2cm的空隙（上样用），聚合20-30min。将酶液与6×加样缓冲液（含pH6.7的0.75 mol/L Tris-HCl、30%甘油、0.01%溴酚蓝）混合，上样后，利用pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲系统（25mmoL/L Tris、250mmol/L甘氨酸），于4℃进行恒流（10mA）电泳，待样品进入分离胶后，再将电流升至15mA，继续电泳。上样前，若样品浓度太低，可用聚乙二醇-20000进行适当浓缩。
1.2.6.2粗毛栓菌木聚糖酶的电泳回收
待活性-PAGE溴酚蓝颜料至离分离胶底部约1.5cm时，停止电泳，取出并分离玻璃板，并使凝胶附着在一块玻璃板上。用刀片纵向切去凝胶两边的部分（每边约1cm宽）。酶样品在凝胶的两边沿处往往略呈弓形，不宜用来进行酶的定位，故将凝胶的两边部分切除。用刀片沿凝胶一侧纵向切去宽约 1cm 的胶条，将此胶条的分离胶部分从上到下切成2mm长的胶块，放在相应编号的EP管中，捣碎胶块，然后向每个EP管中分别加入 50L的1%燕麦木聚糖，置于45℃ 水浴锅中保温 1.5h，再向每个EP管中分别滴加100L 1% DNS， 沸水浴煮 15min。观察各管中颜色变化。进行显色反应期间，用保鲜膜覆盖剩余胶块，并置于4℃冰箱中暂时保存。显色之后，用直尺量出胶块上待回收的部位，并用刀片将其切割下来，放入塑料管中，于-20℃保存。
2 结果与分析
2.1实验结果
2.1.1木糖标准曲线   
在上述条件下，得木糖标准品浓度与光密度值的关系，见表2-1
表2-1木糖浓度与光密度值的关系
木糖标准品(mg/mＬ)  0.2 0.4 0.6 0.8 1
光密度值（OD550ｎｍ） 0.101 0.280 0.464 0.622 0.747

以木糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制出标准曲线（图2.1）。计算出标准曲线回归方程为：A = 0.817x－0.047（R2 =0.9947） ，结果表明，在0.2-1mg/mL范围内木糖浓度与光密度值线性关系良好。　
                               图 2.1    木糖标准曲线图
2.1.2 Sephadex G-150 分子筛层析结果
图2.2 粗毛栓菌木聚糖酶的Sephadex G-150柱层析图谱
2.1.3粗毛栓菌木聚糖酶的各步分离纯化结果
粗毛栓菌木原文请找腾讯752018766辣,文-论'文~网http://www.751com.cn 聚糖酶的各步分离纯化结果，见表2-2
表2-2 粗毛栓菌木聚糖酶各步骤的纯化结果

纯化步骤     总酶活（/U）   总蛋白(/mg)    比酶活（U/mg）   回收率%    纯化倍数
purification Total         Total           Specific         Recovery   Purification
  step          activity protein activity           rate fold
硫酸铵沉淀    4.54×105       1.0×104        45.4             100          1

分子筛层析    2.86×104       2.25×102      1.27×102         6.3           2.8

硫酸铵沉淀    2.48×103        3.59         6.90×102         0.05          15.2

2.1.4蛋白质含量标准曲线
在上述条件下测得的牛血清白蛋白浓度与光密度值的关系，见表2-3
表2-3牛血清蛋白浓度与光密度值值的关系
BSA浓度（g/mＬ） 20 40 60 80    100
光密度值（OD595ｎｍ） 0.2355 0.469 0.6755 0.7845 0.9065
得到标准曲线的回归方程为：A=0.00829x+0.1169 (R2=0.9718)，结果表明，牛血清白蛋白量在20-100ug/mL范围内与光密度值线性关系良好（图2.3）。
图2.3蛋白质含量标准曲线
2.1.5电泳后与DNS反应图像
从图中可以看出第2-6管颜色较对照及其它EP管的深，即木聚糖酶存在于分离胶的2-12mm处（以负极至正极的方向）。而第20-28管颜色也较对照及其它管的深，可能是由于指示剂溴酚蓝的影响

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