摘要 本实验主要以粗毛栓菌为材料，收集菌丝体。提取总RNA，做RT-PCR以扩增漆酶cDNA，漆酶DNA得到扩增。原文请找腾讯752018766辣,文-论~文.网http://www.751com.cn
关键词 粗毛栓菌，漆酶cDNA，RT-PCR扩增
PCR Amplification of Laccase cDNA in Trametesec gallica
Student majoring in Biology Ma Song
Tutor Sun Xun
Abstract Total RNA was extracted from Trametes gallica . RT-PCR was carried out for amplification of Laccase cDNA and laccase was amplified.
Key words Trametes gallica, Laccase cDNA, RT-PCR
引言
漆酶（Laccase，Lac）是一种多酚氧化酶, 在结构和功能上与植物抗坏血酸氧化酶、哺乳动物血浆铜蓝蛋白存在着许多相似之处[2]。它是最简单的多铜氧化酶, 一般含有4个铜原子, 分布于3个高度保守的不同结合位点, 每个铜原子在催化机制中都有很重要的作用。漆酶能催化 O2通过4个电子还原成水, 并且伴随着一些酚类底物的氧化[3]。它最早是从漆树的分泌物中发现的, 随后人们发现一些高等真菌也能分泌这种酶。现在人们知道, 漆酶广泛存在于担子菌、半知菌和子囊菌中, 但其中最主要的生产者是担子菌中的白腐菌[4]，粗毛栓菌（Trametes gallica）是一种白腐担子菌，在我国分布广泛，是杨木的一种主要生物降解者。已有研究表明，该菌产漆酶能力较高[5]。
漆酶早期的研究主要集中在体内功能的研究，随着20世纪70年代前后聚丙烯酰胺凝胶电泳和分子克隆等生物学技术的问世, 漆酶的研究也揭开了新的一页。在国外很多菌种的漆酶基因得到了克隆并且进行了分析和鉴定, 一些漆酶基因也实现了其异源表达[6]。漆酶在木质素降解、微生物菌体形态形成等方面具有重要功能[6]，普通微生物产漆酶的量及纯度不足以大规模的工业应用。要工业化生产漆酶，可通过把可高效产漆酶的基因与载体重组，然后导入受体细胞，形成稳定转化子，大批量培养，使漆酶进行异源表达。因此必须进行漆酶基因的测序，了解基因组成及酶切位点等，以便DNA重组时选择合适的限制性内切酶进行有效切割。所以漆酶的模板cDNA提取及大量扩增成为首要工作。传统的模板DNA提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组分，溶解细胞膜，使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用酚-氯仿抽提，然后用乙醇沉淀核酸，供PCR实验用[7]。本实验主要是扩增有效表达漆酶的cDNA片段，因此利用逆转录的方法制备了模板cDNA，并对其进行PCR扩增，此法去除了内含子的干扰，能满足特殊的实验要求。cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
1 实验材料与方法
1.1 菌株及培养方式
白腐担子菌粗毛栓菌系导师孙迅于1997年8月在山东省菏泽市北郊的护城堤上，从被砍伐的杨树上分离得到的。该野生菌株于同年经由山东省科学院生物研究所微生物分类室的马启明先生对其进行了初步鉴定，定名为Trametes gallica FR[5] 。
PDA培养基:去皮土豆200g（加水煮沸，冷却至室温纱布过滤得滤液）；葡萄糖20g；琼脂粉15g补水至1000mL。
按上述配方配制，混合均匀，取10个培养皿和25支10mL的试管，放入高压蒸汽锅灭菌（121℃，30min），冷却至50℃。分装10个培养皿和20支试管中摆斜面。
浅层静置培养基：半纤文素:3g；酒石酸铵:15mg；Mg2SO4•7H2O:150mg；KH2PO4:0.15g；100×微量元素母液:3mL