粗毛栓菌漆酶cDNA的PCR扩增+任务书+开题报告 第3页
培养基Ｃ：Ｎ比为６：１，适于粗毛栓菌中木聚糖酶的培养。按上述比例准确称取各药品置于50mL的小烧杯中，然后用去离子水将这些药品溶解并定容150ml（pH约为6.5），将定容好的培养基溶液均分至两个250mL锥形瓶中，即每瓶50mL。用纱布及塑料纸封好瓶口后放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌（121℃、30min），结束后取出锥形瓶放至室温下冷却。
本实验所用菌种是实验室已经培养好的。
1.2 仪器和试剂
1.2.1 仪器
5417-R型Eppendorf 离心机（德国），TU1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），DYY-8C型水平电泳仪（北京市辣一仪器厂），DYY-III-31A型水平电泳槽(北京市辣一仪器厂)，WFH-201B型紫外透射反射仪（上海精科实业有限公司），干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司），TP600型梯度PCR仪（日本Takara原文请找腾讯752018766辣,文-论~文.网
http://www.751com.cn DEPC水（二乙基焦碳酸盐, diethyl pyrocarbonate）,1×PBS（在1000 mL 灭菌的去离子水中含8g NaCl，0.2g KCl，1.15g Na2HPO4和0.2g KH2PO4，用盐酸调pH7.4，121℃，灭菌20min）, 细胞裂解液{内含CBS(柠檬酸/十二烷基肌氨酸钠/β-巯基乙醇)}， RNA抽提用的Takara试剂盒（日本Takara公司），EDTA；琼脂糖（英国），MOPS{3-（morpholino）propanesulfonic acid};反转录试剂盒（日本Takara公司）；PCR扩增试剂盒（日本Takara公司）；TEA缓冲液，250bp-DNA-Ladder-Marker（日本Takara公司）,NaAc（pH=4）缓冲液。
1.3 准备实验
（1）配1×PBS分装在实际瓶中，不要装满（对于磨砂广口瓶，用双层滤纸片挡住瓶口；对于螺旋瓶盖，可适当松拧几圈）。
（2）用干净毛刷、洗衣粉清洗玻璃研磨器，再用自来水冲洗，最后用去离子水荡洗，带上俩层手套将研钵灌满DEPC，并用聚丙烯膜包扎，浸泡过夜。
（3）将枪头EP管放入烧杯中，加入DEPC，封口浸泡过夜。
（4）用镊子夹住2mL EP管，灌满DEPC，放入烧杯中，浸泡过夜。
（5）带两层手套将研钵中的DEPC倒出，按原样包扎好。用镊子将枪头从DEPC中取出，甩净放入枪头盒中，将EP管取出放入盒中。
（6）将上述用品连同PBS放入灭菌锅中，121℃灭菌30min，于50℃烘箱中烘干。
1.4 总RNA的提取：
使用Chomczynski和Sacchi[6]所提出的酸酚抽提法并略作改动。
（1）将菌丝用纱布过滤出来，用预冷的PBS将培养基等杂质洗净。
（2）取出菌丝体，置于无菌的多层滤纸之间，吸干多余的液体。用灭菌牙签迅速将菌丝体分散并转移大约1g至已经DEPC（二乙基焦碳酸盐, diethyl pyrocarbonate）处理过的20mL玻璃研磨器中，
（3）加入6 mL预冷的RNA抽提变性液[将25g异硫氰酸胍加入35 mL CBS（含0.1 mol/L柠檬酸，pH 4.0， 2%SDS，1%β-巯基乙醇）缓冲液中]，研磨，直至研磨液呈均匀的浆液状。
（4）加入1.2 mL 2 mol/L 的NaAc（pH 4.0）溶液，混合均匀。
（5）将研磨液转移至10只用DEPC处理过的聚丙烯离心管（1.5mL）中，
（6）向每只管中加入600µL酚-氯仿混合液（酚∶氯仿∶异戊醇 = 25∶24∶1），混匀，强力振荡（涡旋）20 sec，冰浴20 min，离心（10,000g，4℃，20 min），除去蛋白质。
（7）取出上层水相两管合一管，至另外5只经DEPC处理过的1.5 mL离心管中，加入等体积氯仿混匀离心（10.000g，4℃，15min），除去残留酚。
（8）氯仿向每只管中加入与样品等体积的冰冷的异丙醇，1/10体积的NaAC缓冲液，上下反转几次（混匀），于-20℃放置30 min以上。离心（10,000g，4℃）20 min，弃去上清液，
（9）重复（6）至（8）步骤。
（10）加入75%乙醇20 mL和2mLNaAc缓冲液，漂洗沉淀，再如上法离心，弃去上清液。
（11）室温开盖（覆盖滤纸）干燥10-20 min到乙醇全部挥发，加入2 mL无RNase的ddH2O，待RNA溶解后，取20 μL用于紫外检测RNA的浓度和纯度，另取10μL用于电泳检测RNA的质量。将其余的分装于若干只0.5mL EP管中，于-20℃保存，备用。
1.5 RNA浓度和纯度的测定
1.5.1 RNA纯度测定
取25μL上述总RNA的提取液和2.5mL去离子水，放入石英比色皿中，混匀，分别在260nm和280nm波长下，用分光光度计测量其光吸收值（ A260 和A 280），通过计算A260和A 280 的比值，如果RNA样品的纯度=OD260/OD280=1.8至2.0，说明纯度较高。
1.5.2 RNA纯度测定
RNA样品浓度计算公式如下：
总RNA样品的浓度（μg/uL）=OD260 ×核酸稀释的倍数×40/1000
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