反应体系加入物 反应条件
10×One Step RT-PCR Buffer 10μL
One Step Enhancer Solution 2μL
dNTO Mixture(10mM each) 4μL
RNase Inhibitor(40U/μL) 2μL
PrimeScriptTM RTase 1μL
TaKaRa TaqTM HS(5U/μL) 1μL
上游特异性引物（20μM） 2μL
下游特异性引物（20μM） 2μL
实验样品（<1μL Total RNA） 2μL
RNase Free dH2O up to 100 μL 94℃ 3min
94℃ 30s
49℃，52℃，55℃，58℃ 30s
72℃ 1min20s
72℃ 5min
4℃ 恒温保存
1.8 DNA电泳
PCR反应结束后，称取0.5 g琼脂糖于50mL 0.5×TAE缓冲液中，加热融化，待不烫时倒入胶槽中，冷却，凝固。取25μL PCR扩增产物与5μL上样缓冲液{内含溴粉蓝（蓝紫色）和二甲苯青（蓝色）}，混匀，立即将样品上样于已预电泳5min的加样孔中{点两道，DNA marker（每个加样孔10μL）同时上样于样品道旁边}，在0.5×TBE电泳缓冲液中恒压（1-5 V/cm）电泳（本实验实际用110V）。待染料到达凝胶底部约1/4处时，停止电泳，将凝胶浸入含溴乙锭（0.5μg/mL）的0.1 mol/L乙酸铵溶液中染色30 min。最后用WFH-201B型紫外透射反射仪显像，并拍照。
2 结果与分析
2.1 总RNA提取后的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果
mRNA的质量（分子的完整性和纯度）在随后的反转录反应中，是决定能否获得全长cDNA的关键因素之一，在细胞内，RNA主要由以下几类分子组成：rRNA（占RNA总量的80%～85%）、tRNA和核内小分子RNA（占10%～15%）、mRNA（占1%～5%）。根据沉降系数，真菌的rRNA一般可以分为25S（在高等动植物，一般为28S）、18S和5.8S等几类。由于rRNA在总RNA中含量多而种类少，所以根据它们的密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳或离子交换层析就可以将它们分离。尽管mRNA分子种类繁多，但是其含量少，分子量大小也很不均一，所以在电泳图谱上，往往呈微弱的弥散形分布。对新制备的总RNA中mRNA质量的检测，通常是依赖凝胶电泳技术，通过对rRNA质量的判断而确定的。高质量的总RNA制备物的电泳图谱应当是，28S rR原文请找腾讯752018766辣,文-论~文.网http://www.751com.cn NA和18S rRNA的带形整齐，且无脱尾或弥散现象；有时，28S rRNA带的亮度可达到18S rRNA的2倍。在总RNA的制备过程中，如果由于操作不当或由于RNase的污染而造成28S rRNA和18S rRNA部分降解，那么，在电泳图谱上，它们的带形就会出现严重拖尾或弥散现象，甚至不成带形，一旦出现这种情况，就说明mRNA的质量也已经没有保证了，即不能用于RT-PCR、Northern印迹和分子杂交等研究工作了。因为在总RNA中，mRNA应当是伴随着28S rRNA和18S rRNA的降解而降解的，尤其是由于RNase引起的降解作用更是如此。电泳结果显示RNA条带非常不明显，原因可能是：1.在实验过程中操作失误使RNA未被提取出。2.用于提取RNA样品的量太少。
2.2 总RNA纯度与浓度的检测
用紫外光分光光度计分别测得其在260、 280nm下的吸光度。
RNA样品的浓度= OD260×核酸稀释倍数×40/100。
用分光光度计测量其光吸收值（即A260 和A 280），通过计算A260和A 280 分别为0.46和0.32。比值为1.43。（数据显示杂质较多，又进行了一次提纯后，RNA基本检测不出。本实验使用的RNA为实验室保存的RNA）。
2.3 逆转录及PCR反应
加入设计好的引物和RT-PCR所需的试剂。分成4份，在50℃下保温30min，使RNA逆转录成cDNA；把PCR仪的退火温度分别设置成48℃、52 ℃、55℃、58℃。
扩增时的退火温度使用的是梯度温度，目的用来发现最适退火温度。
核酸电泳图显示第四道最清晰，说明58℃为最适退火温度。
2.4 DNA核酸电泳
将胶放入溴乙锭中染色30min，再放入水中清洗3分钟。在紫外光下观察并拍照。
扩增出的DNA序列经过与marker比较大约为1400bp