粗毛栓菌漆酶的分离纯化 第2页
漆酶(Laccase. EC. 1. 10. 3. 2)是一种含铜的多酚氧化还原酶，广泛分布于真菌分泌物、高等植物、少量细菌和昆虫中[1]，最早是从日本的漆树汁中发现的，是人类最早发现的酶之一，但直到现在，人们对它的认识还不完整[2]。近年来，随着漆酶功能的逐步发现，有关漆酶的研究受到普遍的重视。由于在降解木质素方面的功能，使之在制浆造纸工业，特别是纸浆生物漂白领域得到深入的研究和开发[3,4]，在环保方面也有很大的潜力[5]，可与有毒的酚类作用，使含苯氧基类的除草剂、石油化工废物的物质解去毒性等[6]。
随着应用的不断加深，漆酶的研究和开发越来越受到人们的关注[7]。本文就以漆酶的分离、纯化及其部分性质进行初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
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http://www.751com.cn/ gallica（见下图）。经测定具有较高的漆酶活力。
图1 粗毛栓菌（T. gallica）在麦草上长出的子实体[12]
1.1.2 培养基
高产漆酶液体培养基：KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g,酒石酸铵2 g，麦麸 30g，酵母粉 1g，微量元素母液 2 ml，加去离子水至2300 ml，分装，种子培养基300ml分装在250毫升的三角烧瓶中装6瓶，扩大培养基1000ml分装在250毫升的三角烧瓶中装6瓶，121℃灭菌20min备用。
1.1.3 仪器
恒温培养箱HPS-160(哈尔滨东联电子技术公司)；中空纤文超滤装置；高速冷冻离心机Sigma 2-16K(美国sigma公司)；紫外可见光分光光度计；PHS-3C精密酸度计(上海康议仪器有限公司)；HD-1 核酸-蛋白紫外检测仪、TH-500梯度混合器、HL-2恒流泵(上海泸西分析仪器厂)；BTQ-74-2自动部分收集器(上海医用分析仪器厂)。
1.1.4 试剂
ABTS（0.5mmol/L）；0.25%考马斯亮蓝R-250染液及脱色液；乙酸钠缓冲液（20mmol/L pH 5.5）；NaCl缓冲液（pH4.5）；Q-Sepharose Fast Flow；牛血清白蛋白。
1.2 方法
1.2.1 粗酶液的制备
菌种经麦草培养基于4℃振荡（120 r/min）培养25d后，然后用辣层纱布过滤，得滤液1000毫升(可保存于4℃冰箱中)。
1.2.2 超滤
用中空纤文超滤装置浓缩酶液，至200ml左右，将粗酶液倒出。
1.2.3 硫酸铵盐析
首先在粗酶液中添加固体（NH4）2SO4粉末至30%饱和度，过夜离心（7,000r/min，4℃ ）20 min，除去部分杂蛋白沉淀物，收集上清液；然后将（NH4）2SO4饱和度上调到75%，于4℃静置过夜。
1.2.4 离心
离心（7,500r/min，4℃）20 min原文请找腾讯752018766辣,文-论'文.网
http://www.751com.cn/ 将溶解物装入透析袋（截留分子量为12-14 kDa）内,用去离子水进行透析,2-3小时更换一次去离子水,更换三至四次。
1.2.6 酶活力和蛋白含量的测定
将透析后的酶液倒入烧杯中，得476mL酶液。测定漆酶的总酶活和酶液的总蛋白含量。
1.2.6.1 酶活力的测定
ABTS是测定漆酶酶活常用的底物,底物在漆酶催化作用下首先形成底物自由基,底物自由基在特定的光波波长下有最大的吸光系数,随着底物自由基浓度的增加,吸光度值增大,依据吸光值(OD)随时间变化的关系计算出酶活[9]。3mL的反应液中含有用0.05mol/L的醋酸缓冲液（pH4.0）配制的0.5mmol/L ABTS， 再加入20μL酶液，于20℃下反应3mim，测420nm处的吸光值。（漆酶酶活力计算公式 U/L=n×ΔA×106/23，300×3 (ΔA代表吸光值；n代表稀释倍数；n=250)[10])
1.2.6.2 蛋白含量的测定
在3ml的考马斯亮蓝中加入50ul的酶液。在A595下测定光吸收值。与标准溶液（牛血清蛋白）比对，得出酶液中的蛋白质含量[11]。
1.2.7 酶液浓缩
用聚乙二醇透析酶液，使酶液中多余的水被吸出。使酶液呈浓缩状态，得40mL酶浓缩液。
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