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粗毛栓菌漆酶的分离纯化第3页

更新时间：2011-5-3: 来源：毕业论文

粗毛栓菌漆酶的分离纯化第3页
1.2.8 离子交换柱层析
首先用阴离子交换剂Sepharose-Q Fast Flow装制成一根1.6×20 cm柱，连接核酸-蛋白紫外检测仪和自动部分收集器。上样前预先用200ml(20mmol/L)乙酸钠缓冲液（pH 5.5）平衡交换柱，取2mL的酶浓缩液稀释到40mL上样。上样后用含有0.1～0.5mol/L NaCl缓冲液（pH4.5）进行梯度洗脱，每一试管收集5mL洗脱液。
1.2.9 酶活力和蛋白含量的测定
用上述方法测定每一试管漆酶的活性，收集有活性洗脱液并混合，测定回收后漆酶的总酶活和酶液的总蛋白含量。
1.2.10 酶的回收率和纯化度的计算
回收率= U1/U2（U1:层析前总酶活力；U2:层析后收集酶的总酶活力），纯化度=N1/N2 (N1：层析前的比活力；N2：层析后的比活力）
1.2.11 漆酶的纯化与鉴定
利用活性—聚丙烯酰胺凝胶电泳，用愈创木酚使漆酶显色。鉴定漆酶的纯度，并进行漆酶的回收。
2 结果与讨论
2．1 漆酶的诱导
为获得较高产量的漆酶，本文采用了以麦麸为天然培养基，经振荡培养后，漆酶活力有极大的提高，该菌在利用麦麸生长期间，会分解产生大量的中间产物，这些产物又成了漆酶的诱导物。
2.2 酶液总蛋白含量
2.2.1 牛血清蛋白曲线
得牛血清蛋白浓度与光密度值的关系：

表1．牛血清蛋白浓度原文请找腾讯752018766辣,文-论'文.网http://www.751com.cn/ BSA浓度（μg/ml） 20 40 60 80 100
光密度值（OD595） 0.265 0.483 0.765 0.932 1.036

得到标准曲线的回归方程为：A=0.009955x+0.0989，结果表明，牛血清白蛋白量在0-1mg/mL范围内与光密度值线性关系良好。
图2.牛血清蛋白标准曲线
2.2.2 层析前后蛋白含量
通过考马斯亮染色得层析前后蛋白含量关系如下：
表2．层析前后总蛋白含量关系
Relationship between total protein content before and after chromatography
光吸收值（A）稀释倍数     酶液总量 (mL)   总蛋白含量（mg）
Absorbance      Dilution     Total enzyme      Total protein
层析前           0.965          200             2               34.8

层析后 0.162 1 125 0.792

注：N=n*V*x（N：总蛋白含量；n：稀释倍数；v：溶液总体积；x：1mL溶液的蛋白含量）

2．3 离子交换柱层析结果
离子交换柱剂虽然能对漆酶进行静止吸附，但由于发酵液中存在大量的色素，使洗脱下来的漆酶液呈深黄褐色液体，影响了漆酶的活性，为了得到更为纯化的漆酶，用Q-Sepharose可获得较好的分离效果。收集有酶活性的部分，即得部分纯化的组分[9]。发酵液中大量的色素被吸附在层析材料中，随着洗脱液盐浓度的增大，色素最终被洗脱下来。

表3．纯化的漆酶在紫外-可见分光光度计测定的结果（λ=420nm；20℃）

试管号光吸收值（A）
Absorbance 酶活力 (U/L)
Enzyme activity  试管号光吸收值（A）
Absorbance 酶活力 (U/L)
Enzyme activity
29 0.021 675.966  45 0.184 5922.747
30 0.062 1995.708 48 0.133 4281.116
31 0.102 3283.262 51 0.127 4087.983
32 0.121 3894.805 54 0.120 3862.661
33 0.278 8948.498 57 0.245 7886.266
34 0.454 14613.734 60 0.073 2349.785
35 2.487 80053.648 63 0.107 3444.206
36 2.080 66952.790 66 0.064 2060.086
37 1.609 51791.845 69 0.060 1931.330
38 0.971 31255.365 72 0.059 1899.142
39 0.627 20183.403 75 0.036 1158.798
40 0.496 15965.原文请找腾讯752018766辣,文-论'文.网http://www.751com.cn/ 074 2381.974
42 0.282 9077.253 90 0.081 2607.296
43 0.237 7628.775 93 0.062 1995.708
注：由图示知酶活性主要集中在31到60管之间
以洗脱体积为横坐标，以酶活力值做纵坐标，绘制洗脱曲线见下图：

图3.漆酶洗脱曲线
2.4 漆酶的回收率和纯化度
表4．粗毛栓菌漆酶的回收率和纯化度结果
Summary of the purification of laccase in Trametes gallica

总酶活(U)     总蛋白(mg)    比活力（U/mg）    回收率%      纯化度
　　　　　　　Total activity    Total protein    Specific activity 　Recovery rate 　Purification degree
粗酶液             17012.088       34.8          488.853            100            1
Crude enzyme
阴离子交换层析    　1939.378   　　0.792         2448.710           11.4           5.01
Sepharose-Q fast flow
注：回收率和纯化度没有达到预期结果，可能是由于操作过程中漆酶的流失以及Q-Sepharose离子交换柱的循环使用导致