粗毛栓菌漆酶的酶谱分析 第3页
培养基
1.2.1 PDA培养基 称取去皮马铃薯200g，加适量水煮沸20min，用纱布过滤得滤液，加入葡萄糖（或蔗糖）20g，琼脂粉15g，补足水至1,000 mL，混匀，融化，分装，121℃灭菌20min。此培养基主要用于粗毛栓菌的保存。
1.2.2 固态发酵用微量元素母液（mg/L） CaCl2•2H2O, 700; MnSO4•H2O, 500; FeSO4•7H2O, 500; CuSO4•5H2O, 600; ZnSO4•7H2O, 50; H3BO3, 200; Na2MoO4•2H2O, 200; CoCl2•6H2O, 100。使用时，取2mL该母液加入1,000mL水中，再补加KH2PO4 1g，MgSO4•7H2O 0.5g，自然pH值[3]。
1.2.3 液体培养基 KH2PO4，MgSO4•7H2O，酒石酸铵，葡萄糖，微量元素母液，酵母粉，硫酸锰。此培养基作为粗毛栓菌漆酶产酶培养基[4]。
1.3 主要仪器和试剂
TH-500梯度混合器(伤害沪西分析仪器厂)；Q-sepharoseFF交换柱；XWT-S 小型台式记录仪(上海自动化仪表三厂)；HD-1核酸蛋白检测仪(上海沪西分析仪器厂)；BJQ部分收集器(上海医用分析仪器厂)；LDZX-40AI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)； 振荡培养箱HZQ-X100 和生化培养箱HPS-160（哈尔滨东联电子技术公司）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；电泳仪DYY–8C型（北京市辣一仪器厂）；酸度仪；烘箱等[5]。
所用到的试剂主要有：愈创木酚、TEMED、核黄素、Tris、盐酸、氨基乙酸、溴酚兰、甘油、丙烯酰胺、 N,N’-亚甲双丙烯酰胺等, KH2PO4，MgSO4•7H2O，酒石酸铵，葡萄糖，微量元素母液，酵母粉，MnSO4•H2O。
1.4 菌株培养方式
KH2PO4(0.1%)，MgSO4•7H2O(0.05%)，酒石酸铵(0.2%)，葡萄糖(2%)，微量元素母液(2ML/L)，酵母粉(0.005%)，硫酸锰(20MG)按比例配置2000mL，分8瓶装,每瓶250mL。于121℃灭菌300 min，冷却至30℃左右时，每袋接入约50g活化6d （26℃）的T. gallica菌丝体（接种时用接种铲）。27℃浅层静置培养4周。
1.5 样品的制备
1.5.1 浸提 培养28d后，将培养物取出，按料:水1:7加去离子水，于4℃浸提4h；用6层纱布过滤，弃滤渣；取上清液（即得原酶液）[6]。
1.5.2 盐析 首先在原酶液中添加固体（NH4）2SO4粉末至30%饱和度，搅拌均匀，静置过夜，离心（6000r/min， 15min，4℃）除去部分杂蛋白沉淀物；然后将（NH4）2SO4饱和度上调到75%，于4℃静置3h；离心（7500r/min，20 min，4℃），弃去上清液。
1.5.3 透析 用适量蒸馏水(预冷4h)溶解沉淀，将溶解物注入透析袋（截留分子量为12-14 kDa）内对蒸馏水进行透析。每2-3h换一次水,此过程为2d[7]。
1.6 电泳（垂直板电泳）
活性-聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）[7]。样品分别为那些经过透析后的酶液和浸提后的原酶液。8%分离胶的制备（原文请找腾讯752018766辣,文-论'文.网
http://www.751com.cn/ 0.1 mL 10% TEMED、0.2 mL 0.05%核黄素、11.9 mL dH2O，混匀，灌入DYCZ-28A型垂直板电泳槽的玻璃板间隙中，使液胶的高度为玻璃板纵长的2/3-3/4。使玻璃板距100瓦灯泡约15 cm，光照聚合20-30min。5%浓缩胶的制备(10 mL)：取1.7 mL 30%凝胶储备液、2.5 mL 0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 6.7）、0.05 mL 10% TEMED、0.1 mL 0.05%核黄素、5.65 mL dH2O，混匀，加于分离胶上面的空隙中，加上梳子。再如上法进行光照聚合。进行制备电泳时，将酶液与6×加样缓冲液（含pH6.7的0.75 mol/L Tris-HCl、30%甘油、0.05%溴酚蓝）混合，上样后，利用pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲系统（25mmol/L Tris、250 mmol/L甘氨酸），进行恒流（10mA）电泳，待样品进入分离胶后，再将电流升至15 mA，继续电泳。上样前，若样品浓度太低,可用聚乙二醇-20000进行适当浓缩[8]。
1.7 染色
漆酶具有广泛的底物专一性[9]，例如，2,6-二甲基2, 6-DMO）、愈创木酚和ABTS等都曾分别被用于漆酶活性的检测。本实验为了检测漆酶活性，电泳后,放在底物胶上45℃水浴恒温,放少许醋酸-醋酸钠缓冲液.于200mL,加入125μL愈创木酚,放在37℃恒温箱内1h后拍照。
2 结果与分析
2.1 结果
在分离胶上分别能够看到显色带（图1）为经过透析后的酶液。由于加样量过大导致酶谱未完全分开，不易识别漆酶同工酶。
图1 粗毛栓菌漆酶的活性PAGE分析
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