2实验方法
2.2.1 装管
先用肥皂洗手,然后将圆盘电泳槽的玻璃管洗净,再用0.7%的琼脂糖凝胶封底约0.5厘米,凝固后将配好的胶液加入过硫酸铵用移液枪或注射器移入管内,液面加至管口2mm处,用移液枪轻加入少许水水封,以消除弯月面使胶柱顶端平坦,胶管需20℃保温30min,用虑纸条吸去胶管上端水封。
2.2.2 装槽
水封端向上,将胶管垂直插入圆盘电泳槽内,调节好各管高度记下管号,每支约 1/3在槽上,2/3在槽下,用1%的琼脂粉煮沸后用移液枪均匀涂抹于各个胶管与圆盘孔连接处防止上面液体漏出,上槽加入500ml 0.4M H2SO4,下槽加入500ml 0.4M NaOH,淹没各管口和电极,用注射器吸去管口气泡。
2.2.3 电泳
开启电泳仪,恒压160V聚焦2-3小时,至电流趋近于零不再降低时停止电泳。
2.2.4 剥胶
按常规方法剥胶【8】,将胶条浸于0.2mmoL/L愈创木酚中(含2mg/L CuSO4•5H2O)。
2.2.5显色
将剥好的胶条放入配制好的愈创木酚溶液中显色。
2.2.6拍照
待酶与底物反应一段时间(约2-3小时)后明显可见胶条上有明显的棕色条带时进行拍照处理保存。
3 结果与讨论
3.3.1漆酶酶谱
3.3.2讨论
1、结果:本实验共出现漆酶的同工酶比较明显的有四条,其中有两条显示漆酶的活性很高(或量很大),另外两条不太明显。这四条带中的酶有共同的功能,都能和愈创木酚产生显色反应,但区别是这四条带蛋白质的氨基酸组成不同,导致PH不同。所以电泳后会停留在不同的位置。
2、凝胶的浓度要适宜,浓度太大会使聚合后形成的凝胶孔隙较小,影响蛋白样品的迁移,浓度太小凝胶不易聚合,本实验首先采用终浓度为5%凝胶,结果凝胶难以聚合,影响剥胶。本实验最后采用胶终浓度为7.5%。
3、粗酶液可以加入配制的凝胶中,粗酶液中的漆酶同工酶种类较多,且与底物愈创木酚反应专一性强,又因为酶液在不同的pH梯度电泳时根据酶不同的PH停留的位置是一定的,与什么时候加入酶液无关。
4、底物中加入铜离子,因为漆酶中有铜离子,与底物反应有关,加入会加快反应
5、过硫酸铵是催化剂,加入后胶很快就会聚合,因此最后加入,加毕,摇匀并立即装管.通常化学聚焦的胶液,须在过硫酸铵加入前进行减压抽气处理。本实验不需要抽真空处理也可以并没有影响。
参考文献:原文请找腾讯752018766辣,文-论'文[网http://www.751com.cn
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致谢
感谢孙迅老师在本实验中认真耐心的指导!孙老师学识渊博,教学严谨,师德高尚 。他为我们提供了很多相关的实验资料,良好的实验环境,同时也帮助我们解决了很多在实验中遇到的难题,使我们的实验得以顺利进行。同时也感谢实验中王卫和祝传顺同学的帮助!