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粗毛栓菌漆酶的酶谱分析圆盘电泳等电聚焦测漆酶酶谱 第3页

更新时间:2011-5-5:  来源:毕业论文
粗毛栓菌漆酶的酶谱分析圆盘电泳等电聚焦测漆酶酶谱 第3页
 PDA培养基
称取去皮马铃薯200g/L,加适量水煮沸20min,用纱布过滤得滤液,加入葡萄糖 20g,琼脂粉15g,补足水至1,000 mL,混匀,融化,分装,121℃灭菌20min。此培养基主要用于粗毛栓菌的保存。
1.1.5 粗酶液的制备
菌种经麦草培养基培养30天后,将培养物取出,加离子水,浸    泡4h,然后用辣层纱布过滤,取上清液。
1.1.6 等电聚焦酶谱分析
等电聚焦原理 等电聚原文请找腾讯752018766辣,文-论'文[网http://www.751com.cn 形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸,在电场中形成正极为酸性,负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷,因此可以在电场中移动;当蛋白质迁移至其等电点位置时,其静电荷数为零,在电场中不再移动,据此将蛋白质 。
1.1.7 胶体溶液的配制
丙烯酰胺贮液(30%丙烯酰胺,交联度3.0%);29克丙烯酰胺和1克甲叉双丙烯酰胺溶于水,定溶至100ml,滤去不容物后存于棕色瓶,4`C可保存数月.配方(胶终浓度7.5%)  单体 2ml   Ampholine 0.5ml   dH2O 5.5ml   TEMED 8μl     10% 过硫酸铵 50μl    粗酶液 80ul 总体积8ml。

2实验方法
2.2.1 装管 
先用肥皂洗手,然后将圆盘电泳槽的玻璃管洗净,再用0.7%的琼脂糖凝胶封底约0.5厘米,凝固后将配好的胶液加入过硫酸铵用移液枪或注射器移入管内,液面加至管口2mm处,用移液枪轻加入少许水水封,以消除弯月面使胶柱顶端平坦,胶管需20℃保温30min,用虑纸条吸去胶管上端水封。
2.2.2 装槽
水封端向上,将胶管垂直插入圆盘电泳槽内,调节好各管高度记下管号,每支约 1/3在槽上,2/3在槽下,用1%的琼脂粉煮沸后用移液枪均匀涂抹于各个胶管与圆盘孔连接处防止上面液体漏出,上槽加入500ml 0.4M H2SO4,下槽加入500ml 0.4M NaOH,淹没各管口和电极,用注射器吸去管口气泡。
2.2.3 电泳
开启电泳仪,恒压160V聚焦2-3小时,至电流趋近于零不再降低时停止电泳。
2.2.4 剥胶
按常规方法剥胶【8】,将胶条浸于0.2mmoL/L愈创木酚中(含2mg/L CuSO4•5H2O)。
2.2.5显色
将剥好的胶条放入配制好的愈创木酚溶液中显色。
2.2.6拍照
待酶与底物反应一段时间(约2-3小时)后明显可见胶条上有明显的棕色条带时进行拍照处理保存。

3 结果与讨论
3.3.1漆酶酶谱
3.3.2讨论
1、结果:本实验共出现漆酶的同工酶比较明显的有四条,其中有两条显示漆酶的活性很高(或量很大),另外两条不太明显。这四条带中的酶有共同的功能,都能和愈创木酚产生显色反应,但区别是这四条带蛋白质的氨基酸组成不同,导致PH不同。所以电泳后会停留在不同的位置。
2、凝胶的浓度要适宜,浓度太大会使聚合后形成的凝胶孔隙较小,影响蛋白样品的迁移,浓度太小凝胶不易聚合,本实验首先采用终浓度为5%凝胶,结果凝胶难以聚合,影响剥胶。本实验最后采用胶终浓度为7.5%。
3、粗酶液可以加入配制的凝胶中,粗酶液中的漆酶同工酶种类较多,且与底物愈创木酚反应专一性强,又因为酶液在不同的pH梯度电泳时根据酶不同的PH停留的位置是一定的,与什么时候加入酶液无关。
4、底物中加入铜离子,因为漆酶中有铜离子,与底物反应有关,加入会加快反应
5、过硫酸铵是催化剂,加入后胶很快就会聚合,因此最后加入,加毕,摇匀并立即装管.通常化学聚焦的胶液,须在过硫酸铵加入前进行减压抽气处理。本实验不需要抽真空处理也可以并没有影响。
参考文献:原文请找腾讯752018766辣,文-论'文[网http://www.751com.cn
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致谢
感谢孙迅老师在本实验中认真耐心的指导!孙老师学识渊博,教学严谨,师德高尚 。他为我们提供了很多相关的实验资料,良好的实验环境,同时也帮助我们解决了很多在实验中遇到的难题,使我们的实验得以顺利进行。同时也感谢实验中王卫和祝传顺同学的帮助!

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