Isolation and Purification of MnP in Trametes gallica Fr.
Student majoring in Biology Science Wang Jianxi
Tutor Sun Xun
Abstract： The crude enzyme from wheat straw solid culture of Trametes gallica Fr. was ultra-filtrated, salted-out, dialyzed and applied to Sepharose-Q Fast Flow ion exchange column. A component with manganese peroxidase activity was obtained.
Key words: Trametes gallica Fr.，Manganese Peroxidase，ion exchange chromatography.
引言
(1) 锰过氧化物酶（MnP）及其产生菌
木质纤文素(lignocellulose)主要由纤文素(cellulose)、半纤文素(hemicellulose)和木质素(lignin)组成,是自然界中广泛存在的可再生的数量巨大的生物质（biomass）资源。木质素是由苯丙烷衍生物单体构成的一种结构复杂的立体网状物质，是第2大类天然聚合物,在数量上仅次于纤文素。由于木质素立体结构的复杂性,所以绝大多数微生物不易对其进行生物学降解。木质素的微生物降解作用是文持自然界生物碳素循环的重要组成部分。降解木质素的微生物主要是一些可分泌胞外过氧化物酶的白腐真菌,这些酶参与对木质素大分子聚合物的最初裂解反应。木质素生物降解的酶系主要包括木质素过氧化物酶(lignin peroxidase, LiP) [1，2]、锰过氧化物酶(manganese peroxidase, MnP) [3，4，5]和漆酶（laccase）[6] 。 这些酶可在木质素聚合物内形成自由基,导致键的不稳定从而打断木质素大分子[7]。在许多真菌中,MnP是木质素起始降解的关键酶,因为MnP可产生强氧化态的Mn3+,Mn3+作为可扩散的氧化还原介质裂解木质素聚合物中的芳香环部分,然后在其它酶的协同作用下,最终导致大分子的断裂[8]。
MnP是于1984年由Kuwahara等人首先从黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）的培养液中检测到的[9]。随后,这方面的工作逐渐展开，MnP是一种依赖H2O2的胞外酶，催化反应需要Mn2+，MnP在环境保护方面具有潜在的重要应用价值，白腐菌是已知的唯一能把木素彻底降解为CO2和H2O的一类微生物。目前已从多种白腐菌中分离纯化到该酶，如Ceriporiopsis subvermispora，Dichomitus squalens，Panus tigrinus，Phanerochaete chrysosporium，Phlebia radiata，其中对黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）研究最为深入[8]。
(2) MnP的催化机制
当H2O2和二羧酸螯合剂（如丙二酸盐和草酸盐）存在时，MnP能氧化Mn2+成为Mn3+，Mn3+与某些有机酸（如草酸、丙二酸、苹果酸、酒石酸、乳酸等）络合形成稳定的氧化还原电势，后者作为可扩散的氧化还原介质进一步氧化各类酚型化合物，如2，6-二甲氧基酚、香草丙酮和苯酚等[10,11,12]
(3) MnP的工业应用
锰过氧化物酶（MnP）的底物专一性弱，可氧化各类芳香化合物，所以具有极高的工业应用潜力，如生物制浆、纸浆的酶法漂白、有机污染物的降解和环境的生物修复等。在环境保护中，工业“三废”、化学农药分解时往往产生毒性物质，MnP能将其逐步降解为二氧化碳。在造纸工业中，MnP在纸浆的生物漂白方面有很大的应用前景。在褐煤的生物降解中，微生物对低阶煤具有脱硫、液化等能力，可减少能源的浪费和环境的污染，成为研究的热点，所以研究MnP具有很重要的价值。
由于MnP底物的多样性及酶本身结构、基因编码、调控表达的复杂性, 国内的研究尚处于初期阶段; 国外的研究虽然取得一定进展, 但对于MnP的分子生物学、高效表达体系的构建等研究尚有待深入。本实验是在对粗毛栓菌（T.gallica）进行麦草粉固态培养60d，对MnP进行分离纯化，以获得具有MnP活性的组分，并对其进行部分性质研究，以便为将来有效地克隆编码这些酶类的基因，建立高效表达体系奠定必要的工作基础[8]。
1 材料与方法
1.1 主要仪器及试剂
HZQ-Q全温振荡器（中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；电泳仪DYY-8C型（北京市辣一仪器厂）；生化培养箱HPS-250；梯度混合器TH-500（上海沪西分析仪器厂）；恒流泵HL-2（上海沪西分析仪器厂）；核酸蛋白检测仪原文请找腾讯752018766辣,文-论'文.网http://www.751com.cn HD-1（上海沪西分析仪器厂）；自动部分收集器BJQ-74-2（上海医用分析仪器厂）；阴离子交换剂Q-Sepharose Fast Flow购自Pharmacia公司；紫外分光光度计TU-1810（北京普析通用仪器有限公司）；立式自动电热压力蒸汽灭菌锅LDZX-40AI(上海申安医疗器械厂)。
1.2 菌株及培养基
1.2.1 菌株
白腐担子菌粗毛栓菌系孙迅博士于1997年8月在山东省菏泽市北郊的护城堤上，从被砍伐的杨树上分离得到的。 同年山东省科学院生物研究所微生物分类室的马启明先生对其进行初步鉴定，定名为Trametes gallica Fr.[13]。研究证明该菌具有降解木质素的能力，如图1。
图1 粗毛栓菌（T.gallica）在杨木上长出的子实体[14]
1.2.2 培养基
无机盐液（g/L）:KH2PO4 ,1g;MgSO4 ,0.5g;(NH4)2SO4 ,3g
微量元素母液（2mL）： MnSO4 •H2O,0.0784mg；NaCl，0.14mg；FeSO4•7H2O,0.014mg；CoCl2•6H2O,0.026mg；ZnSO4•7H2O,0.0.014mg； CuSO4 •5H20,0.02184mg；KAl(SO4)2 •12H2O 0.0014mg；H3BO4,0.0014mg；Na2MoO4•2H2O,0.0014mg；CH3COOCl，0.021mg
1.2.3 原酶的来源
已在本实验室培养近60天的粗毛栓菌，生长于袋装麦草粉上，每袋内含过10木筛的风干杨木锯末500g以及1.5Kg无机盐水溶液，共三袋。