粗毛栓菌Mnp的分离与纯化+文献综述 第3页
粗酶液的制备
培养60天后，培养物与过夜预冷的去离子水（4℃）以1：8的比例混合，4h并每隔半小时搅拌一次，然后用中空纤文超滤装置进行超滤浓缩。弃去滤渣，共获取滤液500mL；在粗酶液中添加固体硫酸铵粉末82克,至30％饱和度（每100mL加硫酸铵16.4g）,并缓慢搅拌,使硫酸铵完全溶解，于4℃下静置过夜;离心(6000rpm 4℃) 15min，除去沉淀物，留取上清液;将上清液硫酸铵的饱和度上调到75％（每100mL溶液加28.5g粉末状硫酸铵），于4℃下静置过夜;离心(7500rpm 4℃ )20min, 弃去上清液，留取沉淀;用适量的蒸馏水溶解沉淀，将溶解物装入透析袋（12-14KDa）内，对预冷的蒸馏水透析。每隔4h换一次去离子水水，于4℃下透析。
1.4 离子交换层析
用阴离子交换剂Q-Sepharose Fast Flow 装制成一根1.6×20cm柱，连接梯度混合器、恒流泵、核酸-蛋白检测仪和自动部分收集器。
柱的装填：把层析柱固定在架子上，层析柱必须与地面垂直，否则装好的柱床表面倾斜，影响层析分离的效果。装柱时，离子交换剂要分几次加入。如果待第一次离子交换剂在柱中沉淀到十分紧密后，再加入第二批时，两者之间就会产生明显得节痕。在发生上述情况时，可在加第二批之前，先用玻璃棒轻轻搅动第一次沉积的柱床的表面，使其疏松并有部分的悬浮，然后再加入第二批悬浮液。层析柱装好后，用胶头滴管慢慢的吸取柱床上面的溶液。上样前预先用去离子水平衡，再用20mmol/L的NaAc-HAc缓冲液（pH5.5）平衡交换柱，平衡液体积为柱床体积的3-5倍，直至流出液的pH接近5.5。
加样和洗脱：用恒流泵将透析后的原酶液以1.0mL/min的速度加样于交换柱，上样完毕后，用同样的缓冲液（即20mmol/L的NaAC-HAc pH5.5）洗柱。此时的流出液用烧杯收集。大约5h后，待OD280光吸收峰回到基线，用200mL NaAc-HAc (20mmol/L pH5.5)缓冲液和由此缓冲液配制的200mL的0.4mol/L的NaCl对离子交换柱进行洗脱（梯度溶液由梯度混合器获得，NaCl溶液的浓度由低到高）。 洗脱速度为1.0mL/min,用自动部分收集器收集流出液，每3min收集一管，共收集150管。测定流出液的酶活性，合并具有同样酶活性的流出液。
1.5分析方法
1.5.1 锰过氧化物酶的酶活测定
锰过氧化物酶（Manganese (II) peroxidases, MnPs, EC 1.11.1.13）活力的测定：采用Michael的方法。反应混合液含有2940μL {0.1 mol/L乳酸钠缓冲液（pH 4.5）含0.1 mmol/L MnSO4•H2O}和30μL的0.1 mmol/L H2O2，30μL的柱层析所得酶液，反应体系共3mL。反应由加入H2O2而启动（最后再加）。以第一管作对照（因第一管几乎无酶原文请找腾讯752018766辣,文-论'文.网
http://www.751com.cn 活），测定反应前1 min内在240nm处吸光值的增加，定义每分钟使1μmol/L Mn2+氧化成Mn3+所需的酶量作为1个酶活力单位（U）。乳酸与Mn3+所形成的络合物的摩尔消光系数为6,500 M-1 cm-1。
锰过氧化物酶酶活力计算公式如下：
U/L ＝ n × ΔA × 106 / 6,500
其中，n为酶液稀释倍数，ΔA为反应液在1 min内于240nm处吸光值的变化值。
1.5.2 蛋白含量的测定
采用考马斯亮蓝G-250比色法：此法为染料结合法。
以牛血清白蛋白（BSA）为标准液绘制标准曲线。按下面表格中数据加入试剂：
试管编号
操作 空白 标准蛋白质浓度梯度 样品
0 1 2 3 4 5 Ⅰ Ⅱ Ⅲ
BSA标准液（mL） -- 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 -- -- --
样品待测液（mL） -- -- -- -- -- -- 1.0 1.0 1.0
蒸馏水（mL） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 -- -- --
考马斯亮蓝染液 各5.0mL
反应 各管混均，室温下放置5min。
比色 以0号管为空白参比，测定λ=595nm处的吸光度。
反映总体积为3mL
2 结果与讨论
2.1 MnP的柱层析纯化结果
结果显示，在150个试管中，只有很少的几个试管能够测到酶活，并且这几个试管的编号不是连在一起的，而其他的测不到酶活，也就是说，通过离子交换层析（Q-Sepharose F. F），没有能够得到具有锰过氧化物酶（MnP）活性的组分。
2.2蛋白含量测定结果
牛血清蛋白含量与光吸收值的关系
BSA含量（μɡ） 10 20 30 40 50
光吸收值（OD595） 0.103 0.211 0.354 0.472 0.5285
上一页 [1] [2] [3] [4] 下一页
粗毛栓菌Mnp的分离与纯化+文献综述 第3页下载如图片无法显示或论文不完整，请联系qq752018766
