Zymography of laccases in Trametes gallica Fr.
Student majoring in biotechnology Wang Wei
Tutor Sun Xun
Abstract:The result showed that at least four laccse isoenzymes from Trametes gallica Fr.was abserved on the isoelectric focusing zymogram.
Key words:Trametes gallica, laccase, isoelectric focusing ,Zymogram
引言 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶[1],最早是从日本的漆树汁中发现的,是人类最早发现的酶之一,但直到现在,人们对它的认识还不完整[2]。近年来,随着漆酶功能的逐步发现,有关漆酶的研究受到普遍的重视。由于在降解木质素方面的功能,使之在制浆造纸工业,特别是纸浆生物漂白领域得到深入的研究和开发[3,4],在环保方面也有很大的潜力[5],如漆酶可与有毒的酚类作用,使含苯氧基类的除草剂、石油化工废物的物质解去毒性等[6]。 随着应用的不断加深,漆酶的研究和开发越来越受到人们的关注[7]。本文仅就粗毛栓菌漆酶进行等电聚焦初步分析。
1 材料
1.1 菌种
菌种是由菏泽学院孙迅博士提供。经鉴定为粗毛栓菌Trametes gallica Fr.
1.2 PDA培养基
称取去皮马铃薯200g/L,加适量水煮沸20min,用纱布过滤得滤液,加入葡萄糖 20g,琼脂粉15g,补足水至1,000 mL,混匀,融化,分装,121℃灭菌20min。此培养基主要用于粗毛栓菌的保存。
2 方法
2.1 粗酶液的制备
菌种经麦草培养基培养30天后,将培养物取出,加去离子水,浸泡4h,然后用辣层纱布过滤,取上清液。
2.2 等电聚焦酶谱分析
2.2.1仪器
DYY-8C型电泳仪(北京辣一仪器厂)、圆盘电泳槽DYCZ-27B、电子天平、移液枪。
2.2.2试剂
丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、两性电解质Ampholine、过硫酸铵、TEMED、H2SO4、NaOH、琼脂糖、愈创木酚。
2.2.3 聚丙烯酰胺凝胶溶液配制
1、 丙烯酰胺贮液 29克丙烯酰胺和1克甲叉双丙烯酰胺溶于水,定溶至100mL,滤去不容物后存于棕色瓶。
2、聚丙烯酰胺凝胶配方(胶终浓度7.5%)取4.4mL丙烯酰胺贮液,加入1.1mLAmpholine(40%,pH 3-10),12mLdH2O,17.6uLTEMED(10%),17.6uL过硫酸铵(10%),粗酶液80uL。
2.2.4装管原文请找腾讯752018766辣.文-论'文;网http://www.751com.cn
先用0.7%的琼脂糖凝胶(使用电极液0.4M NaOH溶液配制)将洁净的玻璃管封底约0.5厘米,将配好的丙烯酰胺(含两性载体)胶液加入玻璃管内,液面加至离管口约2mm处,用移液枪轻轻加入少许水。于20℃,聚合30min。
2.2.5装槽
封水端向上,将胶管垂直插入圆盘电泳槽内,调节好各管高度记录管号,上槽加入500mL 0.4M H2SO4,下槽加入500mL 0.4M NaOH,用注射器吸去管口气泡。
2.2.6电泳
开启电泳仪,恒压160V聚焦2-3小时,至电流趋近于零不再降低时停止电泳。
2.2.7剥胶及显色
按常规方法剥胶【8】,将胶条浸于0.2mmoL/L愈创木酚中(含2mg/L CuSO4•5H2O)
2.2.8拍照
待酶与底物反应一段时间(约2-3小时),待胶条上呈现明显的棕色条带时进行拍照。
3 结果与讨论
1、结果,本研究共观察到4条显色带其中两条显色较强,见上图。
2、凝胶的浓度要适宜,浓度太大会影响蛋白样品的迁移,浓度太小凝胶不易聚合,研究曾采用5%凝胶,发现凝胶难以聚合,而且影响剥胶。上图结果用的是7.5%的凝胶。
3、底物中加入铜离子,是为了加快显色反应,因为漆酶中有铜离子,与底物反应有关。