锰过氧化物酶(Manganese Peroxidase，MnP)属氧化还原酶，是真菌分泌的一种糖基化细胞外蛋白，其是一种含铁血红素的糖基化过氧化物酶，在Mn2+和H20：存在时，MnP能氧化分解芳香环多聚体，被认为是木质素降解的关键酶之一，由引起白腐的木腐菌和土壤枯草菌产生。MnP是于1984年由Kuwahara等人首先从黄孢原毛平革菌（Phaneroch原文请找腾讯752018766辣,文'论'文,网http://www.751com.cn/ aete chrysosporium）的培养液中检测到的[9]。MnP可产生强氧化态的Mn3+，而Mn3+作为可扩散的氧化还原介质可以裂解木质素聚合物中的芳环部分，然后在其他酶的协同作用下导致大分子的断裂。所以，MnP是木质素起始降解的关键酶。MnP是一种依赖H2O2的胞外酶，催化反应需要Mn2+，MnP在环境保护方面具有潜在的重要应用价值，白腐菌是已知的唯一能把木素彻底降解为CO2和H2O的一类微生物。目前已从多种白腐菌中分离纯化到该酶，如Ceriporiopsis subvermispora，Dichomitus squalens，Panus tigrinus，Phanerochaete chrysosporium，Phlebia radiata，其中对黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）研究最为深入[8]。
(2) MnP的催化机制
MnP由1个铁血红素基和1个Mn2+构成了活性中心，另外还有两个起稳定结构作用的Ca2+。锰过氧化物酶的活性不仅依赖于H202，还依赖于Mn2+的存在。在温度高于40℃时开始失活，其最佳稳定pH为4.8，加入“惰性”蛋白质(如牛血清蛋白)和Mn2+可提高酶的稳定性。另外，Mn2+、蛋白质(如蛋清蛋白)和α—羟基酸(如柠檬酸)都能促进酶活的提高。
当H2O2和二羧酸螯合剂（如丙二酸盐和草酸盐）存在时，MnP能氧化Mn2+成为Mn3+，Mn3+与某些有机酸（如草酸、丙二酸、苹果酸、酒石酸、乳酸等）络合形成稳定的氧化还原电势，后者作为可扩散的氧化还原介质进一步氧化各类酚型化合物，如2，6-二甲氧基酚、香草丙酮和苯酚等[10,11,12]
(3) MnP的工业应用
锰过氧化物酶（MnP）的底物专一性弱，具有氧化降解各类芳香族化合物的独特能力，所以具有极高的工业应用潜力，如生物制浆、纸浆的酶法漂白、有机污染物的降解和环境的生物修复等。在环境保护中，工业“三废”、化学农药分解时往往产生毒性物质，MnP能将其逐步降解为二氧化碳。在造纸工业中，MnP在纸浆的生物漂白方面有很大的应用前景。在褐煤的生物降解中，微生物对低阶煤具有脱硫、液化等能力，可减少能源的浪费和环境的污染，成为研究的热点，所以研究MnP具有很重要的价值。
由于MnP底物的多样性及酶本身结构、基因编码、调控表达的复杂性, 国内的研究尚处于初期阶段; 国外的研究虽然取得一定进展, 但对于MnP的分子生物学、高效表达体系的构建等研究尚有待深入。本实验是在对粗毛栓菌（T.gallica）进行麦草粉固态培养近60d，对MnP进行分离纯化，以获得具有MnP活性的组分，并对其进行部分性质研究，以便为将来有效地克隆编码这些酶类的基因，建立高效表达体系奠定必要的工作基础[8]。
1 材料与方法
1.1 主要仪器及试剂
HZQ-Q全温振荡器（中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；电泳仪DYY-8C型（北京市辣一仪器厂）；生化培养箱HPS-250；梯度混合器TH-500（上海沪西分析仪器厂）；恒流泵HL-2（上海沪西分析仪器厂）；核酸蛋白检测仪HD-1（上海沪西分析仪器厂）；自动部分收集器BJQ-74-2（上海医用分析仪器厂）；阴离子交换剂Q-Sepharose Fast Flow购自Pharmacia公司；紫外分光光度计TU-1810（北京普析通用仪器有限公司）；立式自动电热压力蒸汽灭菌锅LDZX-40AI(上海申安医疗器械厂)。
1.2 菌株及培养基
1.2.1 菌株
白腐担子菌粗毛栓菌系孙迅博士于1997年8月在山东省菏泽市北郊的护城堤上，从被砍伐的杨树上分离得到的，同年山东省科学院生物研究所微生物分类室的马启明先生对其进行初步鉴定，定名为Trametes gallica Fr.[13]。研究证明该菌具有降解木质素的能力。
1.2.2 培养基
无机盐液（g/L）:KH2PO4 ,1g;MgSO4 ,0.5g;(NH4)2SO4 ,3g
微量元素母液（2mL）： MnSO4 •H2O,0.0784mg；NaCl，0.14mg；FeSO4•7H2O,0.014mg；CoCl2•6H2O,0.026mg；ZnSO4•7H2O,0.0.014mg； CuSO4 •5H20,0.02184mg；KAl(SO4)2 •12H2O 0.0014mg；H3BO4,0.0014mg；N原文请找腾讯752018766辣,文'论'文,网http://www.751com.cn/ a2MoO4•2H2O,0.0014mg；CH3COOCl，0.021mg
1.2.3 原酶的来源
已在本实验室培养近60天的粗毛栓菌，生长于袋装麦草粉上，每袋内含过10木筛的风干杨木锯末500g以及1.5Kg无机盐水溶液，共三袋。
1.3 锰过氧化物酶的分离与纯化步骤
1.3.1 粗酶液的制备
把培养近60d的菌丝体用去离子水浸提4小时，辣层纱布过滤，弃去菌体，留取滤液，得酶液10L。经中空纤文超滤浓缩装置浓缩后，共获得500mL粗酶液。
1.3.2 硫酸铵盐析
向粗酶液中加入82g NH4SO4，使其成为30%饱和度（每100mL加16.4g硫酸铵固体），于4℃静置过夜，离心（6000r/min，15min，4℃），除去杂蛋白沉淀物；然后将硫酸铵饱和度上调至75%（每100mL加28.5g硫酸铵固体），再于4℃静置过夜，离心（7500r/min，20min，4℃），弃上清，用少量蒸馏水溶解沉淀。
1.3.3 透析
用适量的去离子水溶解沉淀，将溶解物装入透析袋（12-14KDa）内，对预冷的蒸馏水透析。每隔4h换一次去离子水水，于4℃下透析。