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粗毛栓菌木聚糖酶cDNA的RT-PCR扩增 第3页

更新时间:2011-5-12:  来源:毕业论文
粗毛栓菌木聚糖酶cDNA的RT-PCR扩增 第3页
1.7 PCR反应
1.7.1 引物的设计
所用引物为孙迅导师对部分高等真菌Xylanse基因编码区进行同源性比较和分析后,根据编码区中的保守序列设计的简并引物,由Takara公司合成。
   primerF:  5ˊatg ttc ccc a(g)ca(c) gt(c)c t(g)cc ct 3ˊ;
   primerR1:  5ˊcta caa gaa cgc ctt ga 3ˊ;
primerR2:  5ˊtc(t)a ga(t)a c(g)gt cga gcc g(a)at 3ˊ;
取每种2μL构成混合引物,以便进行PCR反应。
1.7.2  逆转录
所用的RNA为04级的同学所提取的,利用日本Takara公司生产的反转录试剂盒进行逆转录。在0.5mL EP管中加入25μL粗毛栓菌的总RNA、2μL dNTP Mixture、Primer的混合物,混匀后,于干式恒温器中65℃保温5min,冰上速冷,然后加入8μL 5×Buffer、1μL RNase Inhibitor 、2μL RTase(即逆转录酶),于干式恒温器中 52℃保温1小时,再用70℃保温5min。

1.7.3  木聚糖酶cDNA的PCR扩增及检测
利用日本Takara公司生产的PCR扩增试剂盒进行扩增。25μL的反应体系中含2μL上述第一链cDNA合成物,17μL灭菌ddH2O,2.5μL 10×PCR缓冲液,2μL dNTP混合物,1μL 混合PCR Primer ,Taq酶0.5μL。温和地混匀后,稍稍离心,放入梯度PCR扩增仪中,进行PCR反应,条件如下:94℃ 3min(预变性);94℃ 30sec,49--58℃ 30sec,72℃ 1:20 sec,(30个循环);72℃ 5min;4℃恒温保存。并对其扩增结果进行上述类似的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.8   PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
PCR反应结束后,称取0.5 g琼脂糖于50mL 0.5×TAE缓冲液中,加热融化,待不烫时倒入胶槽中,冷却,凝固。取22.5μL PCR扩增产物与2.5μL上样缓冲液{内含溴粉蓝(蓝紫色)和二甲苯青(蓝色)},混匀,立即将样品上样于已预电泳5min的加样孔中{点两道,DNA marker(每个加样孔10μL)同时上样于样品道旁边},在电泳缓冲液中恒压(1-5 V/cm)电泳(本实验实际用110V)。待染料到达凝胶底部约1/4处时,停止电泳,将凝胶浸入含溴乙锭(0.5μg/mL)的0.1 mol/L水溶液中染色30 min。最后用FR-200紫外与可见分析装置现象,并拍照。

2  结果与分析
2.1  总RNA提取后的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果
mRNA的质量(分子的完整性和纯度)在随后的反转录反应中,是决定能否获得全长cDNA的关键因素之一[8],在细胞内,RNA主要由以下几类分子组成:rRNA(占RNA总量的80%~85%)、tRNA和核内小分子RNA(占10%~15%)、mRNA(占1%~5%)。根据沉降系数,真菌的rRNA一般可以分为25S(在高等动植物,一般为28S)、18S和5.8S等几类。由于rRNA在总RNA中含量多而种类少,所以根据它们的密度和分子大小,通过密度梯度离心、凝胶电泳或离子交换层析就可以将它们分离[2]。尽管mRNA分子种类繁多,但是其含量少,分子量大小也很不均一,所以在电泳图谱上,往往呈微弱的弥散形分布。对新制备的总RNA中mRNA质量的检测,通常是依赖凝胶电泳技术,通过对rRNA质量的判断而确定的。高质量的总RNA制备物的电泳图谱应当是,28S rRNA和18S rRNA的带形整齐,且无脱尾或弥散现象;有时,28S rRNA带的亮度可达到18S rRNA的2倍。在总RNA的制备过程中,如果由于操作不当或由于RNase的污染而造成28S rRNA和18S rRNA部分降解,那么,在电泳图谱上,它们的带形就会出现严重拖尾或弥散现象,甚至不成带形,一旦出现这种情况,就说明mRNA的质量也已经没有保证了,即不能用于RT-PCR、Northern印迹和分子杂交等研究工作了。因为在总RNA中,mRNA应当是伴随着28S rRNA和18S rRNA的降解而降解的,尤其是由于RNase引起的降解作用更是如此[7]。电泳图中未出现RNA带行,原因可能是:在操作过程中带入了RNA酶将提取的总RNA被部分分解了,原文请找腾讯752018766辣~文-论'文.网http://www.751com.cn 也可能是所提取的RNA含量太小,或者提取用的器皿或试剂没有处理好仍残留RNA酶,将提取的RNA分解了。

 2.2  总RNA纯度与浓度的检测
用紫外光分光光度计分别测得其在260、 280nm下的吸光度,分别为0.155和0.080,则:
RNA样品的纯度=OD260/OD280=0.046/0.032=1.44,说明总RNA纯度较低。
RNA样品的浓度= OD260×核酸稀释倍数×40/1000=0.184g/L。
2.3  木聚糖酶cDNA的PCR扩增及检测
将胶放入溴乙锭中染色30min,在紫外光下观察并拍照,明显看到两条亮带,两条带大约为1000bp和1200bp。
3  讨论
     总RNA样品纯度较低,原因是总RNA的抽提过程中蛋白质或酚没有去除干净。  
     电泳图中未出现RNA带型,可能是RNA完全被降解或提取的样品中RNA含量过少。
木聚糖酶cDNA扩增出的两条带有两种可能原因:一是由上游引物分别与两条下游引物各扩增出一条带;二两条带都由其中一条下游引物与上游引物扩增出来,此下游引物在模板上有两个结合位点,较暗的一条带为由结合较疏松的位点扩增出来。
RNA比DNA敏感,易破坏,而RNA酶却比DNA酶分布更广泛,活力更强,一般煮沸RNA酶5-10min时,其75%的活性仍然残存,所以在RNA的提取之前,必须对所要用的实验仪器与试剂进行严格灭菌;逆转录及PCR反应所需要的酶一般比较容易失活,所以在进行实验时,最好在无菌室内快速完成,保持安静[3],以避免人为污染。[

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