1.7.3 木聚糖酶cDNA的PCR扩增及检测
利用日本Takara公司生产的PCR扩增试剂盒进行扩增。25μL的反应体系中含2μL上述第一链cDNA合成物，17μL灭菌ddH2O，2.5μL 10×PCR缓冲液，2μL dNTP混合物，1μL 混合PCR Primer ，Taq酶0.5μL。温和地混匀后，稍稍离心，放入梯度PCR扩增仪中，进行PCR反应，条件如下：94℃ 3min（预变性）；94℃ 30sec，49--58℃ 30sec，72℃ 1：20 sec，（30个循环）；72℃ 5min；4℃恒温保存。并对其扩增结果进行上述类似的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.8 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
PCR反应结束后，称取0.5 g琼脂糖于50mL 0.5×TAE缓冲液中，加热融化，待不烫时倒入胶槽中，冷却，凝固。取22.5μL PCR扩增产物与2.5μL上样缓冲液{内含溴粉蓝（蓝紫色）和二甲苯青（蓝色）}，混匀，立即将样品上样于已预电泳5min的加样孔中{点两道，DNA marker（每个加样孔10μL）同时上样于样品道旁边}，在电泳缓冲液中恒压（1-5 V/cm）电泳（本实验实际用110V）。待染料到达凝胶底部约1/4处时，停止电泳，将凝胶浸入含溴乙锭（0.5μg/mL）的0.1 mol/L水溶液中染色30 min。最后用FR-200紫外与可见分析装置现象，并拍照。
2 结果与分析
2.1 总RNA提取后的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果
mRNA的质量（分子的完整性和纯度）在随后的反转录反应中，是决定能否获得全长cDNA的关键因素之一[8]，在细胞内，RNA主要由以下几类分子组成：rRNA（占RNA总量的80%～85%）、tRNA和核内小分子RNA（占10%～15%）、mRNA（占1%～5%）。根据沉降系数，真菌的rRNA一般可以分为25S（在高等动植物，一般为28S）、18S和5.8S等几类。由于rRNA在总RNA中含量多而种类少，所以根据它们的密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳或离子交换层析就可以将它们分离[2]。尽管mRNA分子种类繁多，但是其含量少，分子量大小也很不均一，所以在电泳图谱上，往往呈微弱的弥散形分布。对新制备的总RNA中mRNA质量的检测，通常是依赖凝胶电泳技术，通过对rRNA质量的判断而确定的。高质量的总RNA制备物的电泳图谱应当是，28S rRNA和18S rRNA的带形整齐，且无脱尾或弥散现象；有时，28S rRNA带的亮度可达到18S rRNA的2倍。在总RNA的制备过程中，如果由于操作不当或由于RNase的污染而造成28S rRNA和18S rRNA部分降解，那么，在电泳图谱上，它们的带形就会出现严重拖尾或弥散现象，甚至不成带形，一旦出现这种情况，就说明mRNA的质量也已经没有保证了，即不能用于RT-PCR、Northern印迹和分子杂交等研究工作了。因为在总RNA中，mRNA应当是伴随着28S rRNA和18S rRNA的降解而降解的，尤其是由于RNase引起的降解作用更是如此[7]。电泳图中未出现RNA带行，原因可能是:在操作过程中带入了RNA酶将提取的总RNA被部分分解了，原文请找腾讯752018766辣~文-论'文.网http://www.751com.cn 也可能是所提取的RNA含量太小，或者提取用的器皿或试剂没有处理好仍残留RNA酶，将提取的RNA分解了。
2.2 总RNA纯度与浓度的检测
用紫外光分光光度计分别测得其在260、 280nm下的吸光度，分别为0.155和0.080，则：
RNA样品的纯度=OD260/OD280=0.046/0.032=1.44，说明总RNA纯度较低。
RNA样品的浓度= OD260×核酸稀释倍数×40/1000=0.184g/L。
2.3 木聚糖酶cDNA的PCR扩增及检测
将胶放入溴乙锭中染色30min，在紫外光下观察并拍照，明显看到两条亮带，两条带大约为1000bp和1200bp。
3 讨论
总RNA样品纯度较低，原因是总RNA的抽提过程中蛋白质或酚没有去除干净。
电泳图中未出现RNA带型，可能是RNA完全被降解或提取的样品中RNA含量过少。
木聚糖酶cDNA扩增出的两条带有两种可能原因：一是由上游引物分别与两条下游引物各扩增出一条带；二两条带都由其中一条下游引物与上游引物扩增出来，此下游引物在模板上有两个结合位点，较暗的一条带为由结合较疏松的位点扩增出来。
RNA比DNA敏感，易破坏，而RNA酶却比DNA酶分布更广泛，活力更强，一般煮沸RNA酶5-10min时，其75%的活性仍然残存，所以在RNA的提取之前，必须对所要用的实验仪器与试剂进行严格灭菌；逆转录及PCR反应所需要的酶一般比较容易失活，所以在进行实验时，最好在无菌室内快速完成，保持安静[3]，以避免人为污染。[