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粗毛栓菌木聚糖酶cDNA的RT-PCR+扩增cDNA片段第2页

更新时间：2011-5-13: 来源：毕业论文

粗毛栓菌木聚糖酶cDNA的RT-PCR+扩增cDNA片段第2页
材料
白腐担子菌粗毛栓菌系菏泽学院孙迅博士于1997年8月在山东省菏泽市北郊的护城堤上，从被砍伐的杨树上分离得到的。该野生菌株于同年经由山东省科学院生物研究所微生物分类室的马启明先生对其进行了初步鉴定，定名为Trametes gallic[3]，图1.1[4]。孙迅博士对木聚糖酶进行酶谱分析时发现在木聚糖底物胶上能够看到2条透明带，表明在原酶样品中可能至少存在2种木聚糖酶。

图1 粗毛栓菌（Trametes gallica）在麦草上长出的的子实体[4]
PCR引物
序号序列编号序列用途碱基个数
1 Primer F 5’atg ttc ccc a(g)ca(c) gt(c)c t(g)cc ct 3’ 上游引物 20
2 Primer R1 5’cta caa gaa cgc ctt ga 3’ 下游引物 17
3 Primer R2 5’tc(t)a ga(t)a c(g)gt cga gcc g(a)at 3’ 下游引物 18

2方法
2.1 菌种的的培养
2.1.1 培养基的配制
    PDA培养基：去皮土豆200g（加水煮沸20min冷却至室温纱布过滤得滤液）；葡萄糖20g ；琼脂粉15g；补水至1000ml，灭菌（121℃、30min）。
    浅层静置培养基：半纤文素3g；酒石酸铵15mg；KH2PO4 0.15g；MgSO4•7H2O 175mg；酵母粉：30mg；100×微量元素母液0.3mL（pH6.5），共五瓶（30mL/瓶），灭菌（121℃、30min）。
2.1.2 菌种的接种
取米粒大小的粗毛栓菌菌丝体块接种到PDA固体培养基上，28℃，培养一周，用于菌种活化。按上述操作，将活化的菌种接种到浅层静置培养基上，28℃，培养9-12天，待其褐变后用于总RNA的提取。
2.2   RNA的提取
2.2.1 实验前的准备
对有关器皿及试剂的处理，按照有关文献所述进行[9]。
2.2.2 提取RNA
1样品的准备
取出在28.7℃恒温培养9-12天的粗毛栓菌培养基，经过四层纱布过滤获取其中的粗毛栓菌菌丝，然后用已预冷的PBS洗净并置于无菌的多层 “新华1号”滤纸之间，吸干多余的液体。
2 RNA的抽提
用灭菌牙签迅速将菌丝体(大约0.4g)转移至已经DEPC处理过的20 mL玻璃研磨器中，加入6 mL预冷的RNA抽提裂解变性液{原文请找腾讯752018766辣,文-论'文.网http://www.751com.cn ，4℃，15min），取出上层水相至另外5只经DEPC处理过的1.5mL EP管中，向每只管中加入与样品等体积的氯仿，离心（10000rpm，4℃，10-15min），取出上层水相至另外2只经DEPC处理过的1.5mL EP管中，向每只管中加入与样品等体积的冰冷的异丙醇，上下反转几次（混匀），-20℃冷冻10-20min，离心（10000rpm，4℃，15min），弃去上清夜，再向每管中分别加入0.5mL 75%的乙醇，离心（10000rpm，4℃，15min），弃净乙醇，室温下开盖静置5-10min，加100µL DEPC水，并于-20℃下保存，备用。
2.3 总RNA的纯度与浓度的测定
取25μL上述总RNA的提取液和2500μL去离子水，放入石英比色皿中，混匀，分别在260nm和280nm波长下，用分光光度计测量其光吸收值，通过计算A260 和A 280的比值测其纯度；并根据以下公式计算总RNA的浓度和提取量。
总RNA样品的浓度（μg/μL）=OD260 ×核酸稀释的倍数×40÷1000
2.4 总RNA的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测
2.4.1 总RNA的电泳
采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳对总RNA进行检测[2]。称取0.4 g琼脂糖于24.8 mL灭菌水中，加热融化，冷却至50℃后加入8mL 5×甲醛胶缓冲液{0.1 mol/L MOPS [3-（morpholino） propanesulfonic acid], pH 7.0；40 mmol/L乙酸钠；5 mmol/L EDTA，pH 8.0}和7.2 mL 37%甲醛，混匀冷却至约60℃时倒入制胶槽中，使凝固。取30L RNA样品与13.3 L 5×甲醛胶电泳缓冲液、23.3L 37%甲醛和66.7L 10mol/L的尿素混合，65℃，保温15 min，于冰浴中速冷，加入10L 6×上样缓冲液，混匀，立即上样（凝胶已预电泳5 min，每个点样孔20L，共2道），点样孔两边分别点一到9L1×甲醛胶电泳缓冲液和1L6×上样缓冲液的混合物，在1×甲醛胶电泳缓冲液中恒压（5 V/cm）电泳，待溴酚蓝染料到达凝胶底部约1/4处时，停止电泳，将凝胶浸入含溴乙锭（0.5 g/mL）的去离子水溶液中染色30 min，然后放入去离子水中漂洗3-5min。最后用FR-200紫外与可见分析装置显像并拍照。