Bacillus xylanase gene的DNAMAN引物设计 第2页
寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27bp。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。
④G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
⑤碱基随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 ⑥引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
⑦引物之间
两引物之间不应存在互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
⑧引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能形成任何二级结构。引物的3′端是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，应尽量避免在引物3′端的第一位碱基是A（容易错配）。引物3′端最佳碱基的选择是G和C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。
⑨引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
⑩密码子的简并
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
2 引物设计步骤[8]及结果
(1)序列查找 ：在NCBI上搜索Bacillus xylanase gene，找到该基因的序列，复制该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
(2)序列同源性比较：用DNAMAN软件进行序列同源性比较。
基因5′端同源性比较：
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基因3′端同源性比较:
（3）引物设计筛选及设计结果：
上游引物Primer1:t(ac)(at) tg(ac) g(ag)a (ct)gc tac (ac)tt (18)
下游引物Primer2:cc(at) g(gt)(ag) g(at)t (gt)cc (tg)tc ca (17)
注：cc(at)为cca或cct，Primer2为3′端比对的互补序列。
3 讨论
在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。序列比对的同源性不高，尝试设计的引物不算很好。把设计好的两条引物用于芽孢杆菌木聚糖酶基因的PCR,用凝胶电泳检测扩增结果，以判断引物设计的好坏。
参考文献：原文请找腾讯752018766辣,文-论'文.网http://www.751com.cn
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