粗毛栓菌木聚糖酶的分离和纯化+开题报告+任务书 第4页

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 取出并分离玻璃板，并使凝胶附着在一块玻璃板上。用刀片纵向切去凝胶两边的部分（每边约1cm宽）。由于酶样品在凝胶的两边沿处往往略呈弓形，不宜用来进行酶的定位，故将凝胶的两边部分切除。再用刀片沿凝胶一侧纵向切去宽约 1cm 的胶条，将此胶条的分离胶部分从上到下切成2mm长的胶块，放在相应编号的EP管中，捣碎胶块，然后向每个EP管中分别加入 50µL的1%桦木木聚糖，置于45℃ 水浴锅中保温 1.5h，再向每个EP管中分别滴加100µL 1% DNS， 沸水浴煮 15min。观察各管中颜色变化。进行显色反应期间，用保鲜膜覆盖剩余胶块，并置于4℃冰箱中暂时保存。
1.2.4 木糖标准曲线的测定
准确称取干燥至恒重的木糖标准品50mg，用蒸馏水溶解，定容至50mL。
按下表在各管中加入各种试剂：
数量 管号
 项目 空白 1 2 3 4 5
含糖总量（mg） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
木糖溶液（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水（mL） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0
DNS试剂（mL） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

将上述试剂加完后，混匀各管，沸水浴5min，冷却至室温，分别用去离子水将各管定容至25mL，混匀。选用光程1cm的比色杯在550nm处比色，用空白管作对照，测各管光密度值，每管重复三次，求平均值。以木糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线[4]。
1.2.5木聚糖酶活力的测定
采用DNS（dinitrosalicylic acid）法即3,5–二硝基水杨酸法[8,10]。取0.9 mL由50mmol/L NaAc-HAc（pH4.5）缓冲液配制的1%桦木木聚糖于25mL刻度试管中，加入0.1mL适当稀释的酶液，于45℃水浴中保温30min后，加入3mL 1% DNS试剂，混匀，在沸水浴中煮15min，冷却至室温，补加水至25mL，混匀，于550nm处测定吸光值。以每分钟催化木聚糖水解生成1mol木糖所需的酶量定为1个活力单位。
木聚糖酶酶活力计算公式如下：
木聚糖酶酶活力（U min-1 mL-1）＝ nA /（150.13 × 30）
其中，n为酶液稀释倍数，A为标准曲线上吸光值所对应的木糖微克数，150.13为木糖分子量，30为酶作用时间（min）。
1.2.6蛋白含量的测定
参照Bradford[9]法：取一系列试管，按下表分别加入下列试剂：
空白 1 2 3 4 5
BSA（100ug/mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
考马斯亮蓝G-250（mL） 5 5 5 5 5 5
蒸馏水（mL） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

将上述试剂加完后，混匀，室温静置2min，选用光程为1cm的比色杯，以不加牛血清白蛋白(BSA)的试管为对照，在595nm处比色。以牛血清白蛋白的浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。取待测样品溶液1mL，加入考马斯亮蓝G-250 5mL，混匀，按上述方法测定595nm的光密度值。平行做3份。比色后，从标准曲线上查出待测样品的蛋白质浓度。
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2.1 木糖标准曲线
   在上述条件下，得木糖标准品浓度与光密度值的关系（表1-1）。
表1-1木糖浓度与光密度值的关系
木糖标准品(mg/mL)  0.2 0.4 0.6 0.8 1
光密度值（OD550） 0.101 0.280 0.464 0.622 0.747
以木糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制出标准曲线（图1.1）。
计算出标准曲线方程为：A = 0.815x－0.047（R2 =0.994）结果表明，在0-0.8mg/mL范围内木糖浓度与光密度值线性关系良好。
图 3-1 木糖标准曲线图
2.2蛋白含量标准曲线
 在上述条件下，得牛血清蛋白浓度与光密度值的关系（表1-2）
牛血清蛋白浓度与光密度值值的关系
BSA浓度（g/mL） 20 40 60 80    100
光密度值（OD595） 0.236 0.469 0.676 0.788 0.906

以牛血清白蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制出标准曲线（图1.2）。
得到标准曲线的回归方程为：A=0.00825x+0.117 (R2=0.971)，结果表明，牛血清白蛋白量在0.2-1mg/mL范围内与光密度值线性关系良好（图1.2）。
图1. 4蛋白含量标准曲线
2.3 粗毛栓菌木聚糖酶柱层析实验结果
木聚糖酶粗酶液经过盐析离心，分子筛层析等纯化步骤结果见表1-3。
表1-3粗毛栓菌木聚糖酶各步骤的纯化结果

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