粗毛栓菌漆酶的初步分离与纯化 第3页
材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌种
菌种(Trametes gallic Fr)是由菏泽学院孙迅教授提供。该菌种系孙迅教授1997年8月从山东菏泽护城河堤的杨树上首先发现并采集分离所得。经初步鉴定为粗毛栓菌(Trametes gallica Fr. )[1]。
1. 1. 2 主要仪器
主要仪器 生产厂家
LDZX-40立式自动电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂
生化培养箱HPS-160 哈尔滨东联电子技术公司
PHS-3C精密酸度计 上海康议仪器有限公司
高速冷冻离心机Sigma 2-16K 美国sigma公司
TH-500梯度混合器 上海泸西分析仪器厂
HL-2恒流泵 上海泸西分析仪器厂
FA2004A分析电子天平 上海精天电子仪器有限公司
XWT-S小型台式记录仪 上海自动化仪表厂
HD-1核酸蛋白检测仪器 上海泸西分析仪器厂
BTQ-74-2自动部分收集器 上海医用分析仪器厂
1. 1. 3 主要试剂
研究中所用的主要试剂有：Q-Sepharose Fast Flow 、MnSO4•H2O、硫酸铵、酵母粉和微量元素、乳酸钠-乳酸缓冲液；0.25％R-250考马斯亮蓝染液及脱色液[9]。
1．1．4 PDA培养基
称取去皮马铃薯40g，加适量水煮沸20min，用纱布过滤得滤液，加入葡萄糖 4g，琼脂粉3g，补足水至200 mL，混匀，融化，分装，121℃灭菌20min。此培养基主要用于粗毛栓菌的保存。
1. 1. 5 高产漆酶液体培养基
KH2PO4 1g，MgSO4•7H2O 0.5g，酒石酸铵 2g，蛋白胨30g，酵母粉 1g，微量元素母液 2 mL，加去离子水至1000 mL。取500ml加去离子水至1L，分装在500mL的三角烧瓶中,共5瓶；另500ml分装入500ml的三角烧瓶中装2瓶。121℃灭菌20min备用。
1．2 方法
1．2．1 粗酶液的制备
菌种在高产漆酶液体培养基培养25天后，将培养物取出，用两层纱布过滤，取上
清液。
1．2．2 粗酶的超滤浓缩
将粗酶液由超滤浓缩装置处理，得到浓度较高的酶液。
1．2．3 硫酸铵盐析
首先在粗酶液中添加固体（NH4）2SO4粉末至30%饱和度，离心（7200r/min， 15 min，4oC）除去部分杂蛋白沉淀物，收集上清液；然后将（NH4）2SO4饱和度上调到75%，于4℃静置过夜。
1．2．4 透析
离心（7200r/min，20 min，4℃），弃去上清液，用适量去离子水溶解沉淀，将溶解物装入透析袋（截留分子量为12-14 kDa）内对去离子水进行透析，2小时更换一次去离子水，更换3-4次。
1．2．5 离子交换柱层析
首先用阴离子交换剂Sepharose-Q Fast Flow装制成一根1.6×20 cm柱，连接核酸-蛋白紫外检测仪和自动部分收集器。上样前预先用原文请找腾讯752018766辣,文-论'文.网
http://www.751com.cn 有漆酶活力的组分。
1．2．6 酶活力的测定
3mL的反应液中含有用0.05mol/L的醋酸缓冲液（pH4.0）配制的0.5mmol/L ABTS 20μL酶液，于20℃下反应3min，测420nm处的吸光值。
1. 2. 7 蛋白含量的测定
参照Bradford[10]法：取一系列试管，分别加入0，0.2, 0.4，0.6，0.8，1.0 mL的标准牛血清白蛋白溶液(100μg/mL)，然后向每试管中分别加入考马斯亮蓝G-250（0.01%）5mL，最后用水补充至6 mL，混匀，室温静置2min，选用光程为1cm的比色杯，以不加牛血清白蛋白(BSA)的试管为对照，在595nm处比色。以牛血清白蛋白的浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。取待测样品溶液1mL，加入考马斯亮蓝G-250 5mL，混匀，按上述方法测定595nm的光密度值。平行做3份。比色后，从标准曲线上查出待测样品的蛋白质浓度。
2 结果与讨论
2．1 漆酶的诱导
为获得较高产量的漆酶，本文采用了高产漆酶天然培养基，经培养，该菌在生长期间，会分解产生大量的中间产物，这些产物又成了漆酶的诱导物[8],因此，漆酶活力有极大的提高，
2．2 离子交换柱层析对漆酶的分离与纯化
离子交换柱剂虽然能对漆酶进行静止吸附，但由于发酵液中存在大量的色素，使洗脱下来的漆酶液呈深黄褐色液体，影响了漆酶的活性，为了得到更为纯化的漆酶，用Q-Sepharose可获得较好的分离效果，收集有酶活性的部分，即得部分纯化的组分[7]。
2. 2. 1 洗脱组分漆酶活力测定结果,见表1。
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