摘要 本实验以粗毛栓菌作为出发菌，进行了漆酶cDNA的PCR扩增。以半纤文素为碳源，用高碳低氮培养基, 培养10d，收集菌丝体，提取总RNA，做RT-PCR。结果显示通过RT-PCR有两条cDNA片段被扩增出来。
关键词 粗毛栓菌，漆酶cDNA，RT-PCR扩增
PCR Amplification of Laccase cDNA in Trametesec gallica
Student majoring in Biology Yu Lin-tian
Tutor Sun Xun
Abstract Total RNA was extracted from Trametes gallica cultivated for 10 days in high C -low N medium. The result showed that two cDNA fragments was amplified by RT-PCR.
Key words Trametes gallica Fr., laccase cDNA, RT-PCR
引言 原文请找腾讯752018766辣:文~论^文.网http://www.751com.cn
漆酶（Laccase，Lac）是一种多酚氧化酶, 在结构和功能上与植物抗坏血酸氧化酶、哺乳动物血浆铜蓝蛋白存在着许多相似之处[1]。它是最简单的多铜氧化酶, 一般含有 4个铜原子, 分布于 3个高度保守的不同结合位点, 每个铜原子在催化机制中都有很重要的作用。漆酶能催化 O2通过 4个电子还原成水, 并且伴随着一些酚类底物的氧化[2]。它最早是从漆树的分泌物中发现的, 随后人们发现一些高等真菌也能分泌这种酶。现在人们知道, 漆酶广泛存在于担子菌、半知菌和子囊菌中, 但其中最主要的生产者是担子菌中的白腐菌[3]，粗毛栓菌（Trametes gallica）是一种白腐担子菌，在我国分布广泛，是杨木的一种主要生物降解者。已有研究表明，该菌产漆酶能力较高[4]。
漆酶早期的研究主要集中在体内功能的研究，随着20世纪70年代前后聚丙烯酰胺凝胶电泳和分子克隆等生物学技术的问世, 漆酶的研究也揭开了新的一页。在国外很多菌种的漆酶基因得到了克隆并且进行了分析和鉴定, 一些漆酶基因也实现了其异源表达[5]。漆酶在木质素降解、微生物菌体形态形成等方面具有重要功能[5]，普通微生物产漆酶的量及纯度不足以满足大规模的工业应用。要工业化生产漆酶，可通过把可高效产漆酶的基因与载体重组，然后导入受体细胞，形成稳定转化子，大批量培养，使漆酶进行异源表达。因此必须进行漆酶基因的测序，了解基因组成及酶切位点等，以便DNA重组时选择合适的限制性内切酶进行有效切割。所以漆酶的模板cDNA提取及大量扩增成为首要工作。传统的模板DNA提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组分，溶解细胞膜，使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用酚-氯仿抽提，然后用乙醇沉淀核酸，供PCR实验用[6]。本实验主要是扩增有效表达漆酶的cDNA片段，因此利用逆转录的方法制备了模板cDNA，并对其进行PCR扩增，此法去除了内含子的干扰，能满足特殊的实验要求。cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
1 材料与方法
1.1 主要仪器及试剂用品
1.1.1主要仪器：
5417-R型Eppendorf 离心机（德国），DYY-8C型水平电泳仪（北京市辣一仪器厂），DYY-III-31A型水平电泳槽(北京市辣一仪器厂)，WFH-201B型紫外透射反射仪（上海精科实业有限公司），干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司），TP600型梯度PCR仪（日本Takara公司），HSP-250生化培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），GZX-GFC•101-1-BS电热恒温鼓风干燥箱（上海博泰实验设备有限公司），TU-1810紫外可见分光光度计（北京谱析通用仪器有限责任公司），微波炉，HZQ-C空气浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）。
1.1.2主要试剂：
0.5%DEPC水（二乙基焦碳酸盐, diethyl pyrocarbonate），1×PBS（在1000 mL 灭菌的去离子水中含NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.15g和KH2PO4 0.2g，用盐酸调pH为7.4，121℃，灭菌20 min）, RNA抽提变性液[25g异硫氰胍加入35mLCBS缓冲液（0.1mol∕L柠檬酸钠缓冲液，pH4.0，2%SDS，1%β-巯基乙醇）中]，酚-氯仿混合液（酚∶氯仿∶异戊醇=25:24原文请找腾讯752018766辣:文~论^文.网http://www.751com.cn :1），异丙醇，75%乙醇，ddH2O，dH2O，琼脂糖，5×甲醛胶缓冲液[0.1mol∕mL MOPS，pH7.0；40mmol∕L乙酸钠；5mmol∕mL EDTA，pH8.0] ，37%甲醛，尿素，含溴以锭（0.5μg∕mL）的0.1mol∕L乙酸铵溶液，RNA抽提用的Takara试剂盒（日本Takara公司）， EDTA；琼脂糖（英国），MOPS［3-（morpholino）propanesulfonic acid］，反转录试剂盒（日本Takara公司），PCR扩增试剂盒（日本Takara公司），TAE缓冲液，250bp-DNA-Ladder-Marker（日本Takara公司），其它试剂均为国产。
1.1.3主要用品：
20mL玻璃研磨器，1000mL锥形瓶，EP管，20μL、100μL、1000μL、5000μL枪头，移液枪(规格：20μL，100μL，1000μL,500μL)，灭菌牙签，灭菌滤纸，玻璃棒，镊子，一次性手套、口罩、帽子，石英比色皿，量筒（100mL），移液管（10mL），烧杯
1.2 菌株及培养方式
1.2.1菌株：
白腐担子菌粗毛栓菌系导师孙迅于1997年8月在山东省菏泽市北郊的护城堤上，从被砍伐的杨树上分离得到的。该野生菌株于同年经由山东省科学院生物研究所微生物分类室的马启明先生对其进行了初步鉴定，定名为Trametes gallica［7］Fr.