生物科学粗毛栓菌漆酶cDNA的PCR扩增+参考文献 第3页

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培养基：
PDA培养基：去皮土豆，200g(加水煮沸20min,冷却至室温纱布过滤的滤液）；葡萄糖，20g； 琼脂粉，15g；补水至1000mL。
按上述配方配制，混合均匀，取10个培养皿和20支10mL的试管，放入高压蒸汽锅中灭菌（121℃，30min）结束后取出，待培养基冷却50℃后分装至10个培养皿和20支试管（10mL)中，摆斜面，冷却至室温制成固体培养基。
浅层静置培养基：半纤文素， 3g；酒石酸铵，15mg； Mg2SO4•7H2O，150mg；KH2PO4，0.15g；酵母粉，30mg；100×微量元素母液，3mL
此培养基是Ｃ：Ｎ比为６：１高碳低氮培养基，适于粗毛栓菌中木聚糖酶的培养。按上述比例准确称取各药品置于50mL的小烧杯中，然后用去离子水将这些药品溶解并定容150mL（pH约为6.5），将定容好的培养基溶液均分至两个250mL锥形瓶中，即每瓶50mL。用纱布及塑料纸封好瓶口后放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌（121℃，30min），结束后取出锥形瓶放至室温下冷却。冷却至35℃左右时，在无菌室内用接种铲从培养了10d的种子培养基中挖取三块米粒大的粗毛栓菌菌丝体, 放入此培养基中，即接种。然后于26℃恒温箱进行培养，并于10d后收获菌丝体。
1.3 PCR引物
    总cDNA的 PCR扩增的引物：
oligo(dT)
lacF: 5ˊ-gct(c) atc ggg cct(a) gtc gca-3ˊ
lacR: 5ˊ-tta ctg gtc gtc agg cga-3ˊ
以上引物是由导师孙迅对真菌漆酶同工酶基因编码区进行同源性比较和分析后，根据编码区中的保守序列所设计的简并引物（由Takara公司合成）。
1.4 总RNA的提取与检测原文请找腾讯752018766辣:文~论^文.网http://www.751com.cn
1.4.1 总RNA的提取
使用Chomczynski和Sacchi[8]所提出的酸酚抽提法并略作改动。
(1)将培养液中的菌丝体转移至三层纱布上，并用上述无菌预冷PBS缓冲液反复冲洗。
(2)取出菌丝体，置于无菌的多层滤纸之间，吸干多余的液体。
(3)用灭菌牙签迅速将菌丝体(大约0.4g)转移至已经DEPC处理过的20 mL玻璃研磨器中，加入6 mL预冷的RNA抽提裂解变性液中研磨，直至研磨液呈均匀的浆液状。
(4)加入1.2 mL 2 mol/L 的HAc-NaAc（pH 4.0）缓冲液，混合均匀。
(5)将研磨液转移至10只用DEPC处理过的1.5mL EP管中，向每只管中加入与样品等体积的（约0.6mL）酚-氯仿混合液（酚∶氯仿∶异戊醇 = 25∶24∶1），混匀，强力振荡（涡旋）20 sec，然后静置冰浴10 min，离心（12000rpm，4℃，20min)。
(6)取出上层水相至另外5只经DEPC处理过的1.5mL EP管中，向每只管中加入与样品等体积的（约0.5mL）氯仿，离心（12000rpm，4℃，10-15min）。
(7)取出上层水相至另外2只经DEPC处理过的1.5mL EP管中，向每只管中加入与样品等体积的冰冷的异丙醇，上下反转几次（混匀），-20℃冷冻10-20min，离心（12000rpm，4℃，15min），弃去上清夜。
(8)再向每管中分别加入1mL 75%的乙醇，离心（12000rpm，4℃，15min），弃净乙醇，室温下开盖静置5-10min。
(9)重复过程（4）-（8）再抽提纯化一次。
(10)加100µL DEPC水，并于-20℃下保存，备用。
1.4.2 总RNA纯度与浓度的检测
    取25L上述总RNA的提取液和2.5mL去离子水，放入石英比色皿中，混匀，分别在260nm和280nm波长下，用TU-1810紫外可见分光光度计测量其光吸收值，通过计算A260 和A 280的比值测其纯度；并根据以下公式计算RNA样品浓度，总RNA的浓度（g/L）= OD260  × 核酸稀释倍数 × 40 ÷ 1000。
1.4.3 总RNA的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳[1]
称取0.4 g琼脂糖于24.8 mL灭菌水中，加热融化，冷却至60℃后，加入8mL 5×甲醛胶缓冲液{0.1 mol/L MOPS [3-（morpholino） propanesulfonic acid], pH 7.0；40 mmol/L乙酸钠；5 mmol/L EDTA，pH 8.0}和7.2 mL 37%甲醛，混匀，冷却至约50℃时，倒入制胶槽中，使凝固。取30 L RNA样品与13.3 L 5×甲醛胶电泳缓冲液，23.3 L 37%甲醛和66.7 L 10mol/L的尿素混合，65℃，保温15 min，于冰浴中速冷，加入15 L 10×上样缓冲液，混匀，立即上样（凝胶已预电泳5 min），在1×甲醛胶电泳缓冲液中恒压（5 V/cm）电泳，待溴酚蓝染料到达凝胶底部约1/5处时，停止电泳，将凝胶浸入含溴乙锭（0.5 g/mL）的0.1mol/L乙酸铵溶液中染色30 min，后将其放入有MgCl2的dH2O中浸泡3分钟，最后用WFH-201B型紫外透射反射仪显像，拍照。
1.5 RT-PCR
1.5.1逆转录及PCR
    利用日本Takara公司生产的反转录试剂盒进行逆转录。逆转录及PCR所用试剂盒配方如下：
试剂 体积（μL）
10×One Step RT-PCR Buffer
One Step Enhancer Solution
dNTP Mixture（10mM each）
RNase Inhibitor（40Ｕ∕μＬ）
PrimeScriptTM RTase(for 1 step)
TaKaRa Ex TaqTM HS (5U∕μL)
上游特异性引物（20μM）
下游特异性引物（20μM）
实验样品原文请找腾讯752018766辣:文~论^文.网http://www.751com.cn
RNase Free dH2O 10
在0.5mL EP管中加入上表中的试剂（此步实验样品RNA为本室保存的RNA），于干式恒温器中50℃保温半小时。
    温和地混匀后，稍稍离心，放入梯度PCR扩增仪中，进行PCR反应，条件如下：94℃ 3min（预变性）；94℃ 30sec，49℃-58℃（分4个梯度，分别在1、5、8、12行）30sec， 72℃ 1 min20s，上述共30个循环；72℃ 5min；4℃恒温保存。

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