生物科学粗毛栓菌漆酶cDNA的PCR扩增+参考文献 第4页
PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
PCR反应结束后，称取0.75 g琼脂糖于50 mL 0.5×TAE缓冲液中，加热融化，冷却至约50℃时，倒入制胶槽中，使凝固。取25 L PCR扩增产物与5 L上样缓冲液[内含溴粉蓝（蓝紫色）和二甲苯青（蓝色）}，混匀，立即上样(凝胶已预电泳5 min) ]点四道，每道10μL，DNA marker（每个加样孔7.5L）同时上样于样品道旁边}，在0.5×TAE电泳缓冲液中恒压（5 V/cm）电泳。待染料到达凝胶底部约1/5处时，停止电泳，将凝胶浸入含溴乙锭（0.5 g/mL）的去离子水溶液中染色30 min 。最后用WFH-201B型紫外透射反射仪显像，拍照。
2 结果与讨论
2.1 总RNA电泳结果
mRNA的质量（分子的完整性和纯度）在随后的反转录反应中，是决定能否获得全长cDNA的关键因素之一。由于rRNA在总RNA中含量多而种类少，所以根据它们的密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳或离子交换层析就可以将它们分离。尽管mRNA分子种类繁多，但是其含量少，分子量大小也很不均一，所以在电泳图谱上，往往呈微弱的弥散形分布。对新制备的总RNA中mRNA质量的检测，通常是依赖凝胶电泳技术，通过对rRNA质量的判断而确定的。高质量的总RNA制备物的电泳图谱应当是，28S rRNA和18S rRNA的带形整齐，且无脱尾或弥散现象；有时，28S rRNA带的亮度可达到18S rRNA的2倍。在总RNA的制备过程中，如果由于操作不当或由于RNase的污染而造成28S rRNA和18S rRNA部分降解，那么，在电泳图谱上，它们的带形就会出现严重拖尾或弥散现象，甚至不成带形，一旦出现这种情况，就说明mRNA的质量也已经没有保证了，即不能用于RT-PCR研究工作。因为在总RNA中，mRNA应当是伴随着28S rRNA和18S rRNA的降解而降解的，尤其是由于RNase引起的降解作用更是如此[9]。本次实验结果电泳并未出现理想的图谱，原因分析可能主要是由于RNA样品在抽提过程中在RNase作用下裂解或匀浆处理不彻底或者是总RNA量太少所致。
2.2 总RNA浓度与纯度
在260nm波长下，1OD值的光密度相当于单链RNA浓度的40μg/mL，所以本实验所提总RNA样品的浓度为：OD260 ×核酸稀释的倍数×40÷1000=0.46 ×（2500/2.5）×40/1000=0.184g/L，在反转录时，40L反转录液中的总RNA的浓度为0.184×(25/40)=0.115g/L。
测得OD260，OD280值分别为0.46和0.32, 所以OD260 /OD280的比值为1.44，说明总RNA纯度较低，经分析原因很有可能是因为样品中混有酚和蛋白质的缘故。
2.3 PCR扩增结果
由于之前RNA提纯效果不理想，所以在进行RT-PCR过程中所用的RNA为本实验室保存的RNA，PCR扩增结果如下：
粗毛栓菌漆酶cDNA的PCR扩增
1道，48℃
2道，52℃
3道，55℃
4道，58℃
如图中可以看出，四个温度梯度中，4道58℃时条带最为明显，证明在58℃时PCR扩增效果最好。扩增出来的两条cDNA长度一条约为1450bp左右，另一条约为1200bp左右。
RNA比DNA敏感，易受降解，而RNA酶却比DNA酶分布更广泛，活力更强，一般煮沸RNA酶5-10min，其75%的活性仍然残存，所以在RNA的提取之前，必须对所要用的实验仪器与试剂进行严格灭菌。
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9. 孙讯.2004. 用基因芯片技术研究粗毛栓菌的差异表达基因. 四川大学博士学位论文，第三章.
致谢
在论文即将完成之际，首先对指导我实验的孙迅老师表示真诚地感谢。此过程中，孙迅老师严谨的工作态度，务实的工作作风以及无私的奉献精神都给我留下了深刻的印象并使我获益匪浅。
同时感谢同一实验室的马松、燕涛、伍豪同学在我实验过程之中给予的帮助和建议，正是由于大家的互相帮助，相互关心，相互学习，使得我们有了一个很好的学习氛围和实验环境，得以顺利完成这次毕业设计。相信在此过程中培养的团队协作意识会令受益终生。
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