Separation and Purification of Lignin Peroxidase in Trametes gallica
Majoring in Biology Zhou Linchao
Tutor Sun Xun
Abstract： Trametes gallica was cultivated in wheat straw powder for 60 days. The crude enzyme by ultrafiltrating, salting and dialysis, was applied to Q-Sepharose FF ion exchage column. The effluent with Lignin peroxidase acticity was obtained.
Key words： Trametes gallica, lignin peroxidase, ion exchage chromatography
引言
随着人类对环境污染和资源危机等问题的认识不断深入 ,天然高分子所具有的可再生、可降解等性质日益受到重视。废弃物的资源化与可再生资源的利用 ,是当代经济与社会发展的重大课题 ,也是对当代科学技术提出的新要求。制浆造纸工业的废液中含有大量的木质素成分，白腐菌是目前己知能够将木质素彻底降解为二氧化碳和水的唯一生物。粗毛栓菌优先降解木质素 ,是生物制浆中原料预处理的优良菌株[5]。因此，研究白腐菌对木质素的降解有利于资源的有效利用和保护环境，对人类社会的可持续发展具有重要的现实意义，其应用前景十分广阔[11]。
木质素过氧化物酶（LiP）最早在白腐真菌中发现，也是目前研究最清楚的木质素降解酶，有研究表明，粗毛栓菌能够产生具有木质素过氧化物酶活性的原酶液，但由于产量较少，尚不能用于大规模高效处理造纸废液[7] [8] [9] 。本论文在前人研究的基础上，重点对粗毛栓菌木质素过氧化物酶进行分离纯化工作，并进行酶活测定，进一步探究本实验条件下粗毛栓菌木质素过氧化物酶的产量，对于研究粗毛栓菌木质素过氧化物酶的工业化应用具有重要的理论意义。
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1.1菌株
本实验通过从粗毛栓菌中分离纯化出木质素过氧化物酶，从而对其酶的性质进行初步的研究。本实验室拥有现成的具有较强降解木质纤文素能力的菌株—粗毛栓菌（Trametes gallica）白腐担子菌粗毛栓菌，该菌系孙迅博士于1997年8月在山东省菏泽市北郊的护城堤上，从被砍伐的杨树上分离得到的。该野生菌株于同年经由山东省科学院生物研究所微生物分类室的马启明先生对其进行了初步鉴定，定名为Trametes gallic。已有研究表明，该菌具有较强的降解木质纤文素的能力。木质素过氧化物酶在木质素的降解过程中起主要作用[2] [3] [5]。
1.2 主要仪器及试剂
主要仪器 生产厂家
TU-1810 紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司
生化培养箱HPS-160 哈尔滨东联电子技术公司
PHS-3C精密酸度计 上海康议仪器有限公司
高速冷冻离心机Sigma 2-16K 美国sigma公司
TH-500梯度混合器 上海泸西分析仪器厂
HL-2恒流泵 上海泸西分析仪器厂
FA2004A分析电子天平 上海精天电子仪器有限公司
XWT-S小型台式记录仪 上海自动化仪表厂
HD-1核酸蛋白检测仪器 上海泸西分析仪器厂
BTQ-74-2自动部分收集器 上海医用分析仪器厂
中空纤文超滤装置 河北省华泰净化技术工程有限公司
电泳仪DYY-8C型 北京市辣一仪器厂
主要试剂
25 mmol/L酒石酸缓冲液（pH 3.0）、 2.5 mmol/L藜芦醇、0.5 mmol/L H2O2和适量酶液. 试剂除阴离子交换剂Q-Sepharose Fast Flow和Sephadex G-150购自购自Pharmacia公司外，其余试剂均为国产分析纯或化学纯试剂。
1.3 培养基 [1]
微量元素母液（1L）：MnSO4•H2O, 39.2mg; NaCl, 70mg; FeSO4•7H2O，7mg; CoCl2•6H2O, 12.8mg; ZnSO4•7H2O,7mg; CuSO4•5H2O, 10.92mg; Alk(SO4)2•12H2O, 0.7mg; H3BO4, 0.7mg; Na2MoO4•2H2O, 0.7mg; 氯乙酸，105mg.
无机盐液（g/L）：MgSO4•7H2O, 0.5g; (NH4) 2SO4•7H2O，3g; KH2PO4，1g;微量元素母液2ml.