1978年Kan和 Dozy创立的限制性片断长度多态性（restriction fragment length polymorphism , RFLP)连琐分析技术是最早用于分析已知点突变的方法。其检测特点是：具有较高的特异性，可以确定突变的部位及性质，重复性好。但不足之处是仅适合于多态性的检测：即突变频率大于1%才能被检测到；因此，RFLP分析对于检测突变的早期，尤其是在野生型远多于突变型时其敏感性就显得不足了。原文请+QQ324,9114辣.文^论,文'网
为了能够提高 RFLP 分析技术的敏感性，1999年 Jekins 等人对其进行了改良，创立了一种名为反向限制性位点突变分析（iRSM），进行低突变频率等位基因的检测。
由于该方法在RFLP分析之前用另一种内切酶对靶序列进行消化，减少了野生型序列的含量（一般消化率>99%），因而大大提高了突变序列的检出率。值得注意的是：只要选择适当的限制性酶切位点，此项技术适应于任何基因、突变或生物体。但是，由于聚合酶的关系，可能在PCR扩增后导致iRSM分析出现假阳性。这可以通过使用高保真聚合酶进行修正；同时为了提高检出率，iRSM分析可于其它分析技术联合使用或增加目的基因的含量[16]。毕业论文
http://www.751com.cn/④ 基因芯片（gene chip）
基因芯片技术（gene chip）是指：将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400）探针分子固定在支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。它是基于特异性探针与目的 DNA 杂交的原理发展起来的一种分析方法，可用于大规模检测基因突变、基因多态、基因表达水平以及测定 DNA 序列。
基因芯片检测突变的原理是：将许多已知序列的核苷酸DNA被排列在一块集成电路板上，彼此之间重叠一个碱基，并覆盖整个所需检测的基因，通过RT-PCR扩增得到的正常 cDNA 和突变 cDNA 分别用荧光标记，并与两块 DNA 芯片杂交，由于至少一个碱基的差异，正常 cDNA 和突变 cDNA 将会得到不同的杂交图谱，通过共聚焦显微镜分别检测两种 cDNA 分子产生的荧光信号即可确定是否存在突变。探针与样品完全匹配所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的5~35倍，所以对荧光信号强度精确测定是实现检测特异性的基础。将生物传感器与芯片技术相结合，通过改变探针阵列区域的电场强度也证明可以检测基因（ras等）的单碱基突变[15]。
⑤ 扩增阻碍突变系统（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）
扩增阻碍突变系统（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）是一种在 PCR 基础上发展起来用于检测 DNA 中各种点突变的新方法，其依据的基本原理是：Taq DNA 聚合酶缺少 3′ 到 5′ 外切酶活性，因此对于3′ 末端错配的引物，以低于正常末端配对引物的速度延伸，当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时，3′ 末端碱基则因磷酸二酯键形成困难而不能延伸，反应终止，也就得不到特异长度的扩增条带，从而表明模板 DNA 没有与引物 3′ 末端相应的突变；如果PCR结果能得到特异长度的扩增条带，表明模板 DNA 上具有与引物 3′ 末端相应的突变[23]。
因此针对不同的已知突变，设计适当的引物，可以通过 PCR 方法和电泳图谱直接达到区分突变型和野生型的目的。在突变点的两侧分别设计一对外引物和一对特异性内引物，特异性内引物用来检测突变是否发生，外引物在 PCR 反应中不但作为阳性参照，而且和特异性内引物分别配对有选择性地扩增突变型和野生型个体基因。这样既节约费用，又可以简化后来的优化过程。
以 G 到 A 突变为例（图1-1），下游内引物和上游内引物分别设计为和 G、A 等位基因匹配，因此 PCR 过程中特异性扩增 G 和 A 等位基因。在突变点两侧设计一对距突变点长度不同的外引物，在 PCR 中可以得到不同长度的特异性扩增片段，根据电泳图谱中的片段大小和有无，可以判断突变是否发生以及个体的基因型。ARMS-PCR 技术对单核苷酸突变检测具有简便、快速及价格低廉等特点，是该技术在检测SNP中相对其他技术的优点所在，根据3′ 末端特异性引物阻断类型和电泳图谱，可以直接判断个体的基因型[17-22]。
上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页
ARMS-PCR 快速检测 p53 基因外显子突变热点的快速鉴定 第3页下载如图片无法显示或论文不完整，请联系qq752018766
