CATTGACTCGCACTT GCCΟ3′;外显子 2 正向引 应参数如下:94 ℃预变性 3 min ,接着进入第一阶
物:5′ΟCTGTGTGAGTGGAGAATGTGGΟ3′,反向引 段 , 94 ℃变性 35 s,63 ℃退火 40 s,72 ℃延伸 1
物:5′ΟTGGTCCCGCCCC TCTTGAΟ3′,这些引物也 min ,此后每一循环的退火温度依次递减 0. 5 ℃,共
通过计算机辅助设计(Pri
论文范文http://www.chuibin.com/ mer3) ,其余外显子引物参 计12 个循环 ,然后进入第二阶段 ,94 ℃变性35 s,57
[8]
照文献 。所有引物均由 上海生工生物工程有限 ℃退火 40 s,72 ℃延伸 45 s,共计 30 个循环 ,最后
公司合成。 72 ℃延伸 10 min ,PCR产物用 2 %琼脂糖凝胶电泳
1.2.3 DNA 扩增 以基因组DNA 为模板 ,在 ABI 检测。
公司生产的 9700PCR 仪上扩增 , 反应体系如下: 1.2.4 DNA 测序 PCR产物用 Promega 公司提供
dNTP 0. 2 mmol/L ,MgCl2 3. 0 mmol/L ,引物 0. 3 的 WizardTM PCR 产物纯化试剂盒纯化 , 以 PCR
mmol/L ,TaqDNA 聚合酶 2 U ,模板 25 ng ,反应体 反应的引物为测序引物 ,用 PE 公司提供的 Big -
积 25μl。采用 touchΟdown PCR 方法进行扩增 ,反 Dye 末端标记测序反应试剂盒 ,进行双向测序反应 ,反应条件:96 ℃变性10 s,55 ℃退火5 s,60 ℃延伸4 氨基酸;一种突变位于内含子区域 ,突变情况见表
min ,计 30 个循环。反应产物用 70 %乙醇沉淀 ,95 2。DNA 序列见图 2。在 KCNH2 基因未发现癌变。
表 基因
℃变性 5 min 后 ,在 ABI 公司的 377 自动测序仪上 2 KCNQ1 ( GeneBank Accession Number
AJ006345)突变情况
进行测序。
家系成员 突变位置 碱基改变
1.2. 5 数据处理 采用 PolyPhred 软件对测序结
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果进行分析 ,综合正反双向测序结果识别突变位点。 Ο6 Exon2A 119897 C/ C T/ C
Ⅲ18 , Ⅲ26 和 IV 7 Exon9 144706G/ G→G/ C
2 结 果 ⅢΟΟ Ο Ο
6 , ⅢΟ18 , ⅢΟ26 ,和 IVΟ7 Exon12 331010G/ G→G/A
在 KCNQ1 基因所有外
论文范文http://www.chuibin.com/ 显子和附近内含子中发 ⅢΟ18 和ⅢΟ26 Intron13 332078C/ C→T/ C
现了 4 种突变 ,其中 3 种位于外显子区域 ,但不改变
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KCNQ1和KCNH2 基因与家族性猝死的关系 第2页下载如图片无法显示或论文不完整，请联系qq752018766
