浅谈端粒和端粒酶的研究和应用 第5页
第一节 端粒与端粒酶
一,端粒的结构与功能
1972年James Watson提出了"复制末端问题",复制DNA的DNA多聚酶并不能将线性染色体末端的DNA完全复制.也就是说在线性DNA复制时,DNA多聚酶留下染色体末端一段DNA(一段端粒)不复制.
端粒DNA复制的特点是在每次DNA 复制中,每条染色体的3'端均有一段DNA无法得到复制,随着细胞每次分裂,染色体3'一末端将持续丧失50-200bp的DNA,因而细胞分裂具有一定的限度,即分裂寿命.所以端粒的长度可作为细胞的"分裂时钟",反映细胞分裂能力.
真核细胞染色体末端会随着细胞分裂而缩短,这个缩短的端粒再传给子细胞后,随细胞的再次分裂进一步缩短.随着每次细胞分裂,染色体末端逐渐缩短,直至细胞衰老.人类体细胞遵循这个规则从细胞出生到衰老,单细胞生物遵循这个规则分裂后定有其它机制保持单细胞生物传代存活,生殖细胞亦如此.
端粒:是真核细胞线性染色体末端特殊结构.
由端粒DNA和端粒相关蛋白组成.
端粒DNA:为不含功能基因的简单,高度重复序列,
在生物进化过程中具有高度保守性.
不同物种的端粒DNA 序列存在差异.
人类及其它脊椎动物染色体端粒的结构是5′TTAGGG3′的重复序列, 长约15kb.体细胞的端粒有限长度(telomere restriction fragments TRFS)大多数明显短于生殖细胞,青年人的TRFs又显著长于年长者,提示TRFs随着细胞分裂或衰老,在不断变短,主要是由于DNA聚合酶不能完成复制成线性DNA末端所致.
端粒DNA由两条互相配对的DNA 单链组成, 其双链部分通过与端粒结合蛋白质TRF1和TRF2 结合共同组成t环(t loops).这种t 环特殊结构可文持染色体末端的稳定,保持染色体及其内部基因的完整性,从而使遗传物质得以完整复制.缺少端粒的染色体不能稳定存在.
端粒DNA与结构蛋白形成的复合物如同染色体的一顶"帽子",它既可保护染色体不被降解,又避免了端粒对端融合(end-end fusion)以及染色体的丧失,同时端粒能帮助细胞识别完整染色体和受损染色体.在生理情况下,端粒作为细胞"分裂时钟"能缩短,最终导致细胞脱离细胞周期.
二,端粒酶的结构与功能
在端粒被发现以前,人们就推测生殖细胞之所以能世代相传,其中可能存在一种文持端粒长度的特殊机制,体细胞可能正是由于缺乏这种机制,它的染色体末端才面临着致死性缺失(deletion)的危险.因此在正常人体细胞间永生化细胞(immortalized cells)及肿瘤细胞的转化过程中可能也存在着与生殖细胞类似的机制.这些细胞怎样保持细胞具有继续分裂或长期分裂的能力呢 科学家们发现端粒确实随着每次分裂而缩短,但也会被新合成的端粒片断再延长.科学家们怀疑,可能尚有末被发现的酶,该酶具有标准的DNA多聚酶所不具备的功能,能使已缩短的端粒延长,使科学家们兴奋的是到1984年首先在四膜虫中证实了这种能使端粒延长的酶—端粒酶的存在.
一 端粒酶的结构
端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体,由RNA 和结合的蛋白质组成,是RNA依赖的DNA 聚合酶.它是一种特殊的能合成端粒DNA的酶,通过明显的模板依赖方式每次添加一个核苷酸.
端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶
端粒酶RNA(hTR)
端粒酶逆转录酶(TERT)
端粒酶结合蛋白(TEP)
端粒酶RNA(hTR)
端粒酶逆转录酶(TERT)
端粒酶结合蛋白(TEP)
端粒酶RNA是第一个被克隆的端粒酶组分.端粒酶RNA含有与同源端粒DNA序列TTAGGG的互补序列,核糖核酸酶H切割此模板区,能使体外消除端粒酶延长端粒的功能.
人类TERT(hTERT)基因为一单拷贝基因,定位于5p15. 33 ,具有7个保守序列结构域单元和端粒酶特异性结构域单元T.破坏TERT 将消除端粒酶活性并致端粒缩短.
TEP1,生存动力神经细胞基因(SMN) 产物, hsp90 , PinX1, Est1p 和Est3p
1,端粒酶RNA(hTERT)
哺乳动物端粒酶RNAs(hTR和mTR)在许多组织的不同发育阶段,甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛表达.
体内端粒酶RNA 的存在对端粒酶功能至关重要,影响到端粒酶RNA 的稳定性与突变,也可改变体内端粒长度,并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡 .
端粒酶RNA转录模板
远端区参与和底物的结合.
近端区能添加特定的核苷酸,对底物识别并不重要.模板边界区与端粒酶催化亚基TERT结合,也与端粒酶相关因子Est1p和Ku 结合.
2,端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT)
几乎所有存在端粒酶的机体均含有一单独的TERT 基因, 哺乳动物TERT 的转录由许多转录因子,激素和细胞外信号严格控制.不同的转录因子调节hTERT在不同的细胞内含物中的表达.癌基因c-myc是一个受特殊信号调节的可诱导癌基因, 并可与H-Ras,N-Ras,多瘤病毒MT,LT 等癌基因协同作用, 促进细胞无限增殖, 获得永生化并发生癌变.
c-myc 与hTERT
Fujimoto等用c-myc 反义寡核甘酸转染白血病细胞后, 这些细胞中端粒酶活性均能被下调, 而c-myc 正义寡核甘酸无此作用.
Wang等研究发现c-myc在正常人乳腺上皮细胞和二倍体成纤文细胞中诱导端粒酶活性, 并能延长这些细胞的寿命.因此认为癌基因c-myc为一重要的端粒酶激活剂.
存在于hTERT核心启动子中有两个重要的c-myc 结合位点(CACGTG,亦被称为E 盒).c-myc 诱导的hTERT 表达起始速度快,不受细胞增殖或额外的蛋白合成的影响,与c-myc 引起的直接的转录激活一致.但癌基因c-myc 不是唯一与hTERT基因调节有关的转录因子.
近期研究表明,Sp1 协同c-myc 激活hTERT的转录,可能还有其他因子,如Bcl-2 抗凋亡基因,E6HPV16 型蛋白,以及经过一些蛋白激酶的磷酸化使hTERT 上调.但在诸多不同类型的瘤细胞中,致hTERT上调的基本激活剂是c-myc.
TERT内的N-残基对多种功能是重要的, 包括与端粒酶RNA结合,端粒酶RNA 装配和催化作用,与p53 的相互作用和细胞永生化.
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