程,计算出对应的样品浓度大小,实际测定浓度同稀释倍数的乘积数即为最终浓度数值。
8 免疫组化(SABC)法检测肺组织内的NF-κb蛋白表达
(1) 二甲苯梯度稀释液将已制好的蜡块切片脱蜡,脱蜡后的切片放进无水乙醇梯度稀释液内分离二甲苯。自来水下冲洗切片;
(2)已制备的30%H202 40mL与蒸馏水360mL混合,得浓度3%的H2O2室温存放5-9分钟,使内源性过氧化物酶灭活。切片置蒸馏水中冲洗,PBS浸泡6min;
(3)¬¬玻片放在染色架上,浸入pH为6.0的0.01M枸橼酸钠缓冲液内,使缓冲液盖过染色架。不锈钢锅盖封闭,缓慢加热,沸腾6分钟终止加热,放到室温下冷却至常温;
(4) 5%BSA封闭液加入试剂中,37℃反应28分钟,清除多余液体;
(5)滴入兔抗大鼠多克隆抗体,1:50稀释后37℃孵育90分钟。PBS冲洗4次,各10分钟,滴入羊抗兔IgG,1:50稀释后37℃孵育30分钟;
(6)PBS洗3次,各6分钟,滴入试剂SABC。37℃温育30分钟后PBS冲洗3次,各6分钟;
(7)加DAB显色,镜下控制作用时间。可见棕黄色颗粒表示结果阳性;
(8)苏木素复染6-10分钟,用蒸馏水反复冲洗6分钟,浸入饱和Na2HPO4的溶液中各4分钟,取出后洗涤干燥。中性树胶封片,在显微镜下观察。
每批染色都滴加PBS替代一抗作为阴性对照。
10 统计学处理
采用SPSS 13.0统计学软件,进行数据处理分析。资料用均数±标准差( ±S)表示,计量资料多组间比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA ),组间比较采用LSD检验,计数资料组间比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。
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