小儿隐孢子虫病的实验诊断研究
【摘要】 目的 探讨不同检测方法对小儿腹泻粪便中隐孢子虫卵囊（CSO）的诊断效果。方法 对649例急性腹泻患儿的粪便采用7种方法检测CSO：（1）番红-美兰染色法（SMB）；（2）改良抗酸染色法（MAF）；（3）蔗糖漂浮（SSF）后SMB染色法；（4）PBS-乙醚（PBS-E）离心沉淀后MAF染色法；（5）聚蔗糖-泛影酸钠（FSD）纯化后扫描电镜法（SEM）；（6）FSD或Percoll纯化后免疫组化法（ABC）；（7）Percoll纯化后间接免疫荧光法（IFA）。对649例患儿的新鲜粪便标本同时采用前4种方法检测，而对患儿的经预处理低温存放的710份标本（已知阳性86份，已知阴性624份）同时采用7种方法检测。结果 共检出隐孢子虫腹泻病 26例，阳检率4.0 %。SMB和MAF（SMB+MAF）方法的敏感性、特异性分别为80.2 %和94.1 %、61.6 %和98.4 % (P<0.01)，它们的检测准确性分别为92.4 %和93.9 %（P>0.05）, SSF+SMB、PBS-E法+MAF法及ABC法的敏感性、特异性、准确性均为100 %，与SMB、MAF法相比较均有非常显著性意义（P<0.01）。结论 粪便直接涂片SMB法阳检率高，假阳性也高，适宜筛查；MAF法与之相反，漏诊率高；ABC法与金标准IFA法检测效果与IFA法一样，但方法繁琐造价高；SSF或PBS-E法浓集CSO后SMB、MAF法的检测效果与IFA法相似，且经济、简便，是检测粪便中CSO较理想的方法。
【关键词】 隐孢子虫病； 儿童； 荧光免疫测定； 抗体，单克隆
Laboratory study on diagnosis of cryptosporidiosis in children with diarrhea
ZHENG Chengzhong*, LI Weiming, CUI Fengwen, et al.
* Department of Pediatrics, No. 306 Hospital of PLA, Beijing 100101，China
【Abstract】 Objective To evaluate the diagostic effects, sensitivity, specificity and accuracy of 7 different methods in detecting cryptosporidium oocysts (CSO) in fecal specimens of children with diarrhea. Methods Seven microscopy-based CSO detection methods were applied to unconcentrated and concentrated fecal smears from 649 children with acute diarrhea. The seven methods were as follows: (1) A direct hot safranin-methylene blue (SMB) stain method, (2)a direct modified acid-fast (MAF) stain method, (3)a modified Sheather′s sucrose flotation (SSF) plus SMB stain method, (4) a PBS-ether concentration (PBS-E) plus MAF stain, (5) a combination of Ficoll-sodium diatrizoate (FSD) discontinuous density gradient and observation under scanning electron microscope (SEM), (6) FSD or Percoll purifying CSO method plus an avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) technique, and (7) a monoclonal antibody-based indirect immunofluorescence assay (IFA). The first 4 methods listed above were simultaneously used to examine CSO in fresh stool samples from 649 children with diarrhea. All seven methods were used in 710 previously collected, pretreated, stored (at 2-8℃) specimens (86 known positives, 624 known negatives) from 649 children with diarrhea. Results A total of 649 diarrhea cases were examined for fecal CSO, which were identified in 26 cases (4.0%). The sensitivity, specificity and accuracy of the SMB stain and the MAF (or SMB+MAF) method for the fecal CSO were 80.2% and 94.1%, 61.6% and 98.4% (P<0.01), 92.4% and 93.9% (P>0.05), respectively. The sensitivity, specificity and accuracy of the SSF+SMB, PBS-E+MAF, ABC methods were all 100%, which were statistically significant (P<0.01 for all) as compared to those of SMB, MAF or SMB+MAF methods. Conclusions The direct SMB staining of the unconcentrated fecal smears showed a higher positive rate than the one of the direct MAF stain, but its mis-diagnosis rate was higher as well. This test may be suitable for screening. The MAF stain had a high false-negative rate. The detective effect of ABC was the same as IFA with monoclonal antibodies, but the performing process was complicated, manifold and the reagents are expensive. The diagnostic effects of SSF+SMB and PBS-E plus MAF methods were similar, 100% in sensitivity, specificity or accuracy, to one of the gold standard methods-IFA. These two methods were easy in visual recognition, inexpensive, simple and convenient, therefore might be the ideal methods for the detection of fecal CSO.
【Key words】 Cryptosporidiosis; Child; Fluoroimmunoassay; Antibodies, monoclonal
1976年，Nime等［1］ 首次报道了人隐孢子虫性腹泻病（CSS）， 目前普遍认为是一种世界范围的人兽共患疾病，小儿发病率较高，80年代以后相继创建了不少从粪便中检测隐孢子虫卵囊（CSO）技术［2，3］，但这些方法的敏感性、特异性和准确性尚待进一步研究。本研究着重对前人介绍的及我们改良组建的粪便检查技术进行评估，以期寻找经济简便、敏感性高、特异性强、适宜推广的诊断方法。
对象与方法
一、 研究对象
选择以腹泻为主诉，1989年5月～1990年7月初次到第三军医大学新桥医院儿科就诊或住院的12 岁以下小儿为筛查对象，共检测649例。
二、 粪便标本预处理及保存
所有新鲜粪便标本经浓集纯化或检测后，分别以10 %甲醛和2.5 % 重铬酸钾预处理，2～8℃下保存待进一步检测。
三、 诊断标准
1.具有腹泻临床表现。
2.粪便经常规检查、细菌培养（用SS及麦康凯培养基）及轮状病毒检测（ELISA法），除外其它感染性及食饵性腹泻病。
3.粪便检查CSO阳性，全玻片发现一个以上典型CSO者为阳性，基于抗CSO壁单克隆抗体的间接免疫荧光法（IFA）（美国Meridian Diagnostics公司）按试剂提供的阳性、阴性对照试剂判断（此法为诊断金标准）。
四、实验方法
1.直接粪涂片番红-美兰染色法（SMB） 及甲醛沉淀后改良抗酸染色法（MAF）筛查。参照Baxby等［4］的SMB法及 Garcia等［5］介绍的MAF法染色，加以改良，两法同时对腹泻患儿筛查。新鲜粪便涂片光镜下观察，SMB法使CSO染成明亮的橙红色，呈球形或卵圆形，直径4～6 μm,甲醛沉淀后MAF法染色CSO为红色，CSO 浓度较低。
2.蔗糖漂浮法(SSF)浓集CSO+SMB染色法检查：在Current等［6］的技术基础上设计SSF法，将2.5 %重铬酸钾保存的粪标本经两层纱布过滤，取15 ml加入盛有40 ml饱和蔗糖液的塑胶瓶内，混匀， 650×g 离心10 min，取表层液以PBS(pH值 7.2)离心清洗3次，然后行SMB 法染色镜检。SSF法浓集可提高CSO浓度15～40倍，大部分粪渣、真菌、白细胞被去除，浓集后标本经SMB染色法，CSO具有典型的染色特征，每个高倍视野下可见数个至数十个CSO，很容易识别。
3.PBS-E 离心沉淀法浓集CSO加MAF 染色检查： 取过滤后的CSO悬液3 ml，加PBS 6 ml、乙醚1～2 ml，混匀，静置3～5 min,500×g 离心5 min，去除上三层(乙醚、粪渣固体栓、PBS层),沉淀部分以PBS清洗3次，然后进行MAF 染色镜检或4℃存放待进一步纯化处理。PBS-E浓集效果与SSF法相当。
4.聚蔗糖-泛影酸钠密度梯度离心法(FSD)纯化CSO后行扫描电镜(SEM) 观察: PBS-E初步浓集后，参照Lumb 等［7］的FSD法进一步纯化，取纯化后的CSO悬液制备SEM 标本，使用Amray-1000B型扫描电镜观察，测微器直接测CSO大小(μm)。FSD 法使CSO集中在0.5 %聚蔗糖表层条带内，可提高CSO浓度50倍以上,SEM观察CSO形态完整，呈球形或椭球形，测微器测量CSO直径4.1～6.7 μm,偶见脱囊现象（子孢子从囊内脱出）。
5.亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术(ABC)检测CSO：FSD或Percoll密度梯度离心法提纯CSO后进行免疫组化染色。以抗CSO 壁单克隆抗体(meridian Diagnostics Inc.)为第一抗体，生物素标记的抗鼠抗体为第二抗体，Vectastain ABC复合液为第三抗体，二氨基联苯胺(DAB)显色，光镜下观察。ABC法使CSO染成棕红色或古铜色，周边着色浓，中心淡，内部隐约可见新月状结构（SZ），无形态、大小、着色与CSO相似的颗粒样结构，使结果更易判断。
6.间接免疫荧光法(IFA)鉴定CSO: 用Percoll 密度梯度离心法纯化后，CSO集中在第2、3 条带内［8］。取10 μl加在标有“病人”字样的玻片孔内，加抗隐孢子虫卵囊壁单克隆抗体50 μl，室温下湿盒内孵育30 min，置入PBS液(0.01 mol,pH7.6)内浸洗5 min;再加荧光抗体，孵育、浸洗、封片，每批同时做阴性、阳性对照各一孔。用荧光显微镜检测CSO。处理后标本更纯净、CSO浓度更高(100倍以上) 。IFA检查CSO呈现黄绿色荧光，直径2～6 μm ，每高倍显微镜视野见20～100个CSO, 单克隆抗体与其它寄生虫卵、细菌无交叉反应，这些病原体不出现特异性荧光。
五、 实验分组
1.对649例腹泻患儿随机采集的新鲜粪便标本同时运用4种方法检测，即：直接SMB法、直接MAF法、SSF+SMB法、PBS-E+MAF法检测，任一种阳性者，以SEM法、IFA法鉴定确认。
2.取经预处理低温保存的649例患儿的陈旧标本710份，同时采用上述7种方法检测。
辣、 统计学处理
对各种检测方法的敏感性、特异性、准确性，采用专用公式进行u检验［9］（u=1p1-p21/S(p1-p2)。
结果
一、 临床资料及一般检测结果
对649例急性腹泻患儿的新鲜粪便标本逐一进行4种方法同时检测，直接SMB、直接MAF、SSF+SMB、PBS-E+MAF 法的阳检率分别为7.1 %、4.6 %、4.0 %和4.0 %，经SEM、IFA法鉴定，共确诊CSS 26例，占小儿腹泻中的4.0 %(26/649)。CSS患儿年龄3个月～8岁（平均3岁），婴幼儿占58 ％（15/26），6、7、8月份检出18例（69 ％）。所有隐孢子虫病患儿未发现明显免疫功能缺陷及营养不良，粪培养及轮状病毒检测均为阴性。
二、7种方法检测CSO的敏感性、特异性和准确性的结果
同时采用SMB、MAF、ABC、IFA法检测62份标本(其中已知阳性标本11份，另随机采集新标本51份，表1)，结果提示：SMB 和MAF法的敏感性、特异性、准确性分别为93.3 %和73.3 %,89.4 %和97.9 %,90.3 %和91.9 %， ABC法均为100 %。
取预处理后低温存储的陈旧粪便标本 710份(含26例CSS的已知阳性粪便86份，已知阴性624份)采用7种方法单盲法批量检测。结果表明(表2)： SMB法(69/86)比MAF法阳性率高，假阳性率也较高(37/624)。ABC法、SSF+SMB或PBS-E浓集后MAF染色的86份已知阳性标本均呈阳性结果，无假阳性或假阴性。
表1 62份粪便标本4种检测方法的敏感性和
特异性比较（%）
方法 阳性数 假阳性数 假阴数性 敏感性 特异性 准确性
SMB 14
5
1
93.3
89.4
90.3
MAF 11 1 4 73.3 97.9 91.9
ABC 15 0 0 100.0 100.0 100.0
IFA 15 0 0 100.0 100.0 100.0
注：其中已知阳性标本11份，随机采集新标本51份,新检出阳性标本4份；SMB：直接粪涂片番红-美兰染色法，MAF：及甲醛沉淀后改良抗酸染色法，ABC：亲合素-生物素-过氧化酶复合物技术，IFA：间接免疫荧光法，下同
三、各种方法的敏感性、特异性、准确性的统计学处理结果
SMB法与MAF法、SMB+ MAF法、SSF+ SMB法、PBS-E+MAF法及ABC法，除前两者的准确性差异无显著性（P>0.05）外，其余两种方法的敏感性、特异性及准确性相比差异均有显著性（P<0.01）。MAF法与ABC法、SSF+ SMB法及PBS-E+MAF法的敏感性、特异性及准确性相比差异均有显著性(P<0.01),表3。
讨论
一、小儿CSS的发病情况及特点
隐孢子虫感染在不发达地区很常见，占小儿腹泻的3 %～13 %［2，3，10］，本组报告26例，占小儿腹泻的4.0 %，比南京报道［11］的（1 %）阳性率高。夏季高发，这可能与：地区流行差异，检测CSO的方法不同，敏感性不同或重庆温暖潮湿气候特点有关。婴幼儿易感且症状明显。病程1～3周，腹泻停止后持续排CSO 2～4周。
二、 直接SMB与MAF 染色评估方法 标本数 真阳性数 假阳性数 假阴性数 敏感性（%） 特异性（%） 准确性（%） +PV(%) -PV(%)
SMB 710
69
37
17
80.2
94.1
92.4
65.1
97.2
MAF 710 53 10 33 61.6 98.4 93.9 88.9 94.4
SMB+MAF 710 53 10 33 61.6 98.4 93.9 88.9 94.4
SSF+SMB 710 86 0 0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
PBS-E+MAF 710 86 0 0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
FSD+ABC 710 86 0 0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
IFA 710 86 0 0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0
注：其中已知阳性标本86份，已知阴性标本624份;+PV:阳性预告值，-PV:阴性预告值，SSF：蔗糖漂浮法，PBS-E：离心沉淀法，FSD：密度梯度离心法，下同
表3 各种检测方法敏感性、特异性、准确性统计学分析
方法比较 敏感性 特异性 准确性比较
u值 P值 u值 P值 u值 P值
SMB与MAF 2.66 <0.01 3.80 <0.01 0.93 >0.05
SMB与SMB+MAF 2.66 <0.01 3.80 <0.01 0.93 >0.05
SMB与SSF+SMB 4.35 <0.01 6.14 <0.01 8.25 <0.01
SMB与PBS-E+MAF 4.35 <0.01 6.14 <0.01 8.25 <0.01
SMB与ABC 4.35 <0.01 6.14 <0.01 8.25 <0.01
MAF与ABC 6.39 <0.01 3.57 <0.01 8.09 <0.01
MAF与SSF+SMB 6.39 <0.01 3.57 <0.01 8.09 <0.01
MAF与PBS-E+MAF 6.39 <0.01 3.57 <0.01 8.09 <0.01
直接粪涂片SMB染色法敏感性较高（阳检率高），特异性差（阳性结果的验后概率仅为65.1 %），适用于筛查患儿，MAF法与之相反，漏诊率高，但综合考虑敏感性和特异性时，二者的诊断准确性比较差异无显著性（P>0.05）,两法结合可取长补短，可用于初诊患儿。
三、 SSF、PBS-E集卵SMB、MAF染色评价
经SSF、PBS-E处理后，大部分粪渣、细菌、白细胞及其它“抗酸体”被去除，CSO着色良好，每显微镜视野可见数十个大小、形态、着色一致的CSO，使结果很易判断。我们改良组建的SSF、PBS-E浓集加SMB、MAF染色法，浓集和检测效果明显优于甲醛沉淀后加MAF法，SSF、浓集加SMB检测与直接SMB法相比阳性预告值提高了35 %（即降低了假阳性率），PBS-E浓集加MAF检测，提高了CSO浓度，可弥补直接MAF法敏感性低的缺陷，其敏感性、特异性和准确性均为100 ％，特别适用于粪便中CSO含量较少的标本检测，检测效果与金标准（IFA）相当，且经济简便，有临床应用价值。
四、 SEM观察进一步确认CSO
SEM所见与Reduker等［12］观察结果一致，证实了光镜下的CSO存在，有条件时，SEM观察也是较可靠的诊断方法之一。
五、 IFA法的诊断意义
基于单克隆抗体的IFA法无假阳性和假阴性结果［13］，是目前最理想的诊断方法，对首次发现或可疑CSO可提供准确无误的鉴定。但造价高，需有荧光显微镜等设备。
辣、 ABC染色检测效果
ABC染色技术用于检测粪便中CSO的报道极少，我们建立的ABC法使CSO着色好，背景淡，对比度好，容易辨认。因生物素与亲合素之间有高度亲和力（比抗原-抗体的亲和力大100万倍），具有层层放大效应，敏感性高、特异性强，不需要荧光显微镜，是一种值得进一步研究评价的检测手段。
七、 各种纯化CSO技术的作用及意义
纯化后CSO浓度高、纯净，使染色检测容易判断；纯化后CSO仍具有感染活力，为深入进行超微结构、免疫微生物、建立动物模型进行发病机制或药物筛选等研究提供了必要前提。
我们首次经SEM、单克隆抗体（IFA、ABC）鉴定，认为导致重庆地区小儿腹泻的CSO符合小球型(C.parvum)隐孢子虫特点。
（本文编辑：钱越）
作者单位：郑成中（100101 北京，解放军第三○辣医院儿科）
李为明（第三军医大学新桥医院儿科）
崔凤文（第三军医大学新桥医院儿科）
崔守信（第三军医大学新桥医院儿科）
杨颍（第三军医大学新桥医院儿科）
参考文献
1，Nime FA,Burek JD,Page DL,et al. Acute enterocolitis in a human being infected with the protozoan cryptosporidium. Gastroenterology ,1976,70:592-598.
2，Griffiths JK. Human cryptosporidiosis: epidemiology, transmission,clinical, treatment,and diagnosis. Adv Parasitol, 1998,40:37-85.
3，Chacin Bonilla L. Cryptosporidiosis in humans. Invest Clin,1995,36:207-250.
4，Baxby D, Blundell N , Hart CA.The development and performance of a simple, sensitive method for the detection of cryptosporidium oocysts in faeces. J Hyg, 1984,93:317-323.
5，Garcia LS,Bruckner DA,Brewer TC,et al. Techniques for the recovery and identification of cryptosporidium oocysts from stool specimens. J Clin Microbiol, 1983,18:185-190.
6，Current WL,Reese NC,Ernst JV,et al. Human cryptosporidiosis in immunocompetent and immunodeficient persons. N Engl J Med, 1983,308:1252-1257.http://www.751com.cn/
7，Lumb R,Lanser JA, O′Donoghue PJ. Electrophoretic and immunoblot analysis of cryptosporidium oocysts. Immunol Cell Biol, 1988,66:369-376.
8，Kilani RT, Laila Sekla.Purification of cryptosporidium oocysts and sporoites by cessium chloride and Percollgradients. Am J Trop Med Hyg,1987,36:505-508.
9，孙长生.筛查与诊断实验的评价.见：李良寿，主编.临床医学研究原理与方法.西安：陕西科学技术出版社，1995.108-111.
10，Iqbal J,Munir MA,Khan MA. Cryptosporidium infection in young children with diarrhea in Rawalpindi,Pakistan. Am J Trop Med Hyg,1999,60:868-870.
11，韩范.我国发现婴幼儿隐孢子虫病.中华儿科杂志，1989,27:75-76.
12，Reduker DW,Speer CA,Blixt JA. Ultrastructure of cryptosporidium parvum oocysts and excysting sporozoites as revealed by high resolution scanning electron microscopy.J Protozool,1985,32:708-711.
13，Rusnak J,Hadfield TL,Rhodes MM, et al.Detection of cryptosporidium oocysts in human fecal specimens by an indirect immunfluorescence assay with moneclonal antibodies. J Clin Microbiol, 1989,27:1135-1136.表2 710份粪便标本7种检测方法结果比较