毕业论文论文范文课程设计实践报告法律论文英语论文教学论文医学论文农学论文艺术论文行政论文管理论文计算机安全
您现在的位置: 毕业论文 >> 医学论文 >> 正文

幽门螺杆菌长期感染鼠腺胃模型的研究

更新时间:2014-9-10:  来源:毕业论文

幽门螺杆菌长期感染鼠腺胃模型的研究

  【摘要】 目的 建立适合不同研究需要的Hp动物模型。方法 二级Wistar大鼠、二级C57BL/6小鼠及三级BALB/c小鼠各40只,每种动物随机分为实验组(20只)及对照组(20只)。实验组动物接种Hp(sydney strain1,SS1)菌液,小鼠0.4 ml/只,大鼠1.5 ml/只(约109/ml),连续5次,1周完成,而对照组则不作相应处理。距最后一次接种Hp的4、8、12及24周(BALB/c16周)分别处死实验组及对照组动物各5只。取胃粘膜组织评价SS1在不同品系动物的定植及病理组织学改变。结果 4周时所有实验组动物胃窦、胃体Hp检查均阳性,SS1主要定植于胃窦的胃小凹及腺腔,胃体较少;SS1定植量随感染时间的延长有增加的趋势,至24周时仍有明显定植;3种动物的Hp定植量比较,C57BL/6小鼠高于BALB/c小鼠和Wistar大鼠,对照组动物未有Hp定植。病理组织学检查:8周和24周Wistar大鼠、BALB/c和C57BL/6小鼠的胃窦及胃体出现轻至中度慢性活动性胃炎改变,Wistar大鼠炎症细胞浸润的程度较BALB/c及C57BL/6小鼠重。对照组动物未见有炎症反应。结论 SS1 Hp可长期定植于BALB/c、C57BL/6小鼠和Wistar大鼠腺胃,引起慢性活动性胃炎改变,上述模型的建立对于Hp药物筛选、Hp疫苗的研究及Hp致病性的阐明具有重要的应用价值。http://www.751com.cn
  【关键词】 螺杆菌,幽门  模型,生物

  Development of mouse and rat model of Helicobacter pylori infection Zeng Zhirong, Hu Pinjin, Chen Minhu, et al. Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080
  【Abstract】 Objective To develop different rodent model of H.pylori infection as to meet different requirement for different purpose of study. Methods 40 two-grade Wistar rats, 40 two-grade C57BL/6 mice and 40 SPF BALB/c mice were randomly divided into two groups: experimental and control groups. Animals in the experimental group were inoculated orally Hp strain (Sydney Strain 1, SS1) , 0.4ml of inoculum per mouse, 1.5ml per rat (109 organisms/ml) five times for a week. In 4, 8, 12 and 24 weeks after the last bacteria inoculum, 5 animals in the experimental and control groups were sacrificed respectively. Histology and Hp colonization were assessed by HE staining, Gimesa staining, Urease test, and Hp culture. Results In 4 weeks, in all experimental animals bacteria were clearly visible at antrum and body, but the number of Hp colonization varied according to the animal strain. Heavy colonization was seen in C57BL/6 in antrum and body, and in BALB/c and Wistar colonization was located mainly at antrum, less at body, which tended to increase over the experiment time, especially in Wistar. Hp was negative in the controls. All animals had no inflammatory changes in 4 weeks, however, in 8, 12 and 24 weeks in Balb/c, Wistar and C57BL/6 of the experimental group,mild to moderate chronic active gastritis was obsevered in antrum and body, which increased in severity over time, atrophy gastritis was still not seen in 24 weeks. In contrast, in the controls, no remarkable changes were detected. Conclusions SS1 Hp can colonize in the glandular stomach mucosa of BALB/c, C57BL/6 mice and Wistar rats and leads to chronic active gastritis in long-term study. SS1 mouse and rat model is adaptable for animal experimentation of H.pylori including vaccine studies, screening for novel therapeutics and investigation of mechanisms of pathogenesis.
  【Key words】 Helicobacter pylori  Models biological

(Natl Med J China, 1998, 78:494-497)

  幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是胃、十二指肠疾病的重要病因,但其致病机理仍不明确。目前尚无满意的Hp动物模型。为此,我们用一株cagA和vagA基因阳性的Hp菌株感染不同品系的小鼠和大鼠腺胃,以图建立适合不同研究需要的Hp动物模型。

材料与方法

  一 、实验细菌及培养
  本研究所用的Hp菌株由澳大利亚A.Lee教授实验室赠送(命名为sydney strain 1,简称SS1),该菌株经鉴定含有cagA基因和vacA基因。采用改良Skirrow培养基培养,含5%的脱纤文羊血及万古霉素(10 mg/L,美国Lilly公司)、二性霉素(5 mg/L,美国ER Squibb&Sons公司)等抗生素,37℃微氧培养3~5天。Hp的鉴定包括菌落形态、尿素酶试验、涂片观察等。
  二、实验动物
  2级Wistar大鼠,重80~100 g;2级C57BL/6小鼠,7周,重17~20 g;3级BALB/c小鼠,7周,重17~20 g;均为雌性,各40只。所有动物随机分为实验组(20只)和对照组(20只)。以上动物均由中山医科大学实验动物中心提供,饲养条件符合2级动物要求。
  三、Hp的动物灌喂
  用布氏肉汤洗脱Hp菌落,实验组动物通过胃管灌喂Hp菌液,大鼠1.5 ml/只、小鼠0.4 ml/只(约109/ml),连续5次,1周完成;而对照组动物则不作相应处理。所有动物灌喂前禁食12小时。
  四、动物的处理
  于最后一次灌喂Hp菌液计算,隔4、8、12及24周(BALB/c小鼠16周)分别处死实验组、对照组动物各5只。取出胃腔,沿大弯剪开,用生理盐水漂洗。取完整的胃组织(包括十二指肠、胃窦、胃体等)用立体显微镜观察胃粘膜大体改变;一半胃粘膜组织供HE染色和改良Gimesa染色,另一半组织进行尿素酶试验(观察时间24小时)、涂片及Hp培养。
  五、随机引物扩增的DNA多态指模技术(RAPD-PCR)比较SS1Hp菌株和由胃粘膜分离的Hp菌株的指模
  参照我们先前报道的RAPD-PCR方法[1],引物序列为:5′-GTGGATGCGA-3′,PCR扩增条件为94℃预变性5分钟,94℃30秒、36℃30秒、72℃90秒共35个循环,最后72℃后延伸10分钟。PCR产物进行电泳分析(120V 30分钟,EB染色)。
  辣、Hp定植及病理改变的判断标准
  1.Hp定植判断标准[2]:高倍镜下观察10个视野胃小凹的Hp定植情况,以定植量的多少进行计分;0=无Hp定植;1=胃小凹有1~2条Hp,但不是每个胃小凹都有细菌存在;2=多数胃小凹有3~10条Hp;3=几乎所有胃小凹均有成堆Hp。
  2. 胃粘膜病理组织学标准[3]:高倍镜下观察10个视野固有层慢性炎症细胞(淋巴细胞、浆细胞及嗜酸性粒细胞)和中性粒细胞浸润多少,对慢性炎症和炎症活动程度进行计分。慢性炎症:0=固有层偶见淋巴细胞,1=固有层有散在的淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞,2=固有层有较多的淋巴细胞、浆细胞,3=固有层有大量的淋巴细胞、浆细胞;活动性炎症:0=固有层偶见中性粒细胞,1=固有层有散在的中性粒细胞,2=固有层有较多的中性粒细胞,3=固有层有大量的中性粒细胞。

结  果

  一、胃粘膜的尿素酶试验结果
  所有实验组Wistar大鼠、C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠的胃窦、胃体粘膜尿素酶4、8、12和24周(BALB/c小鼠16周)均阳性,而十二指肠粘膜阴性。尿素酶的颜色变化多在2小时内改变,C57BL/6小鼠的胃粘膜尿素酶颜色改变时间短于另两个品系动物。对照组各品系动物的胃粘膜尿素酶均为阴性。
  二、随机引物PCR(RAPD-PCR)结果
  从感染SS1 4周的实验组动物(Wistar大鼠5只、C57BL/6小鼠5只和BALB/c小鼠5只)胃粘膜分离培养Hp,后运用随机引物扩增的DNA多态指模技术(RAPD-PCR)对SS1 Hp菌株和由动物胃粘膜分离的Hp菌株进行分析。结果表明,它们的DNA指模相同,这证实实验组动物感染的Hp为灌喂的SS1 Hp菌株。
  三、大体标本观察
  实验组、对照组各品系动物在4、8、12和24周(BALB/c小鼠16周)均未见有粘膜的糜烂、出血和溃疡等改变。
  四、不同品系动物的Hp定植比较
  实验组动物12周和24周(BALB/c小鼠16周)胃窦及胃体Hp定植结果见表1。改良Gimesa染色可清楚显示Hp,Hp呈S形,多位于胃小凹上半部及胃腺腔内。不同品系的动物其Hp定植存在一定差异(图1~3)。在Wistar大鼠中,灌喂Hp 4周后在胃窦的胃小凹和胃腺腔内可见少量Hp定植,而在胃体粘膜的小凹及腺腔少见;12周后胃窦和胃体Hp定植量有所增加;在BALB/c小鼠中,Hp定植以胃窦为主,而在十二指肠则未见有定植;C57BL/6小鼠胃窦、胃体均可见Hp定植,尤于胃窦部定植较多,12周时明显高于8周。比较这3种品系动物的Hp定植,发现C57BL/6小鼠多于BALB/c小鼠和Wistar大鼠,随时间的增加Hp定植量有增加的趋势。对照组动物胃及十二指肠粘膜未见有Hp定植。

 


图1 Wistar大鼠感染24周后SS1的定植,SS1定植于胃 小凹及腺腔,呈“S”形 改良Gimesa染色 ×1 000 图2 C57BL/6小鼠感染24周后SS1的定植 改良Gimesa染色 ×1 000 图3 BALB/c小鼠感染16周后SS1的定植,定植量低于其它两个品系动物改良Gimesa染色 ×1 000 图4 Wistar大鼠感染SS1 24周后胃窦粘膜固有层见多量的炎症细胞浸润HE ×200 图5 Wistar大鼠感染SS1 24周后胃窦粘膜固有层有一淋巴滤泡形成HE×200 图6 对照组Wistar大鼠24周后胃窦组织学未见明显炎症细胞浸润HE×200 图7 C57BL/6小鼠感染SS1 24周后胃窦组织HE×200 图8 BALB/c小鼠感染SS1 16周后胃窦组织HE×200
五、不同品系动物感染Hp后的胃粘膜组织学变化
  3种动物接种Hp后8、12和24周(BALB/c小鼠16周)胃粘膜组织学改变见表2。感染Hp 4周各品系动物均未见有明显炎症反应。在Wistar大鼠中,8周时实验组Wistar大鼠胃窦粘膜固有层有少量的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和浆细胞浸润,并有少量的中性粒细胞浸润,而胃体较少;感染Hp 12周及24周后浸润的炎症细胞明显增加,其中有1只动物胃窦粘膜固有层有一淋巴滤泡形成;在C57BL/6和BALB/c小鼠中,胃窦及胃体粘膜固有层炎症反应较Wistar大鼠轻,也以胃窦为重(图4~8)。在本实验周期内,实验组动物胃窦及胃体组织未见有萎缩和异型增生改变。对照组动物的胃窦及胃体粘膜无明显炎性细胞浸润。

表1 不同实验组动物Hp定植量的比较


品系     鼠数(只) 时间(周) 胃窦 胃体
Wistar 5 12 1.4 0.6
C57BL/6 5 12 2.4 1.0
BALB/c 5 12 1.2 0.4
Wistar 5 24 2.0 0.8
C57BL/6 5 24 2.6 1.0
BALB/c 5 16 1.6 0.6

注:表中资料为每组动物Hp定植平均分数

表2 实验组动物的病理组织学改变


品系  鼠数
(只) 时间
(周) 胃窦 胃体  
慢性 活动性 慢性 活动性
C57BL/6 5  8 0.8 0.4 0.4 0.4
BALB/c 5  8 0.6 0.4 0.4 0.2
Wistar 5  8 1.0 0.6 0.6 0.2
C57BL/6 5 12 1.0 0.6 0.8 0.6
BALB/c 5 12 0.8 0.6 0.6 0.2
Wistar 5 12 1.4 0.8 0.6 0.4
C57BL/6 5 24 1.4 0.6 1.0 0.4
BALB/c 5 16 1.0 0.6 0.6 0.4
Wistar 5 24 2.0/0.2* 1.2 1.0 0.6

注:表中资料为每组动物病理组织学平均分数* 斜线后为对照组资料(未感染SS1Hp)

讨  论

  本研究所用的SS1 Hp菌株是从有十二指肠球部溃疡病史患者胃粘膜分离而得的,经鉴定含有cagA和vacA基因。我们将该菌株接种于C57BL/6和BALB/c小鼠。结果表明,SS1 Hp可长期定植于C57BL/6和BALB/c小鼠,感染Hp24周时胃窦有较明显的慢性活动性炎症改变,和Lee等[2]报道的SS1小鼠模型相似[2],Hp定植量高于Marchetti等[4]报道的HpBALB/c小鼠模型[4]。
  1991年陈晶晶等[5]报道Hp短期感染Wistar大鼠的研究。为了解Wistar大鼠是否也对SS1易感,我们还将该菌株接种于2级Wistar大鼠,结果发现SS1 Hp也能定植于Wistar大鼠,而且主要定植于胃窦,Hp的定植量随时间的延长有增加的趋势;感染Hp 8周后,胃窦、胃体粘膜出现轻度的慢性活动性炎症,24周后有较明显的炎症细胞浸润,尤以胃窦显著。对照组各品系动物Hp检查均阴性,病理组织学也无慢性活动性胃炎改变。这说明SS1 Hp是一株有很强定植力的菌株,可长期定植于Wistar大鼠腺胃引起类似于Hp感染人胃粘膜出现的慢性胃炎改变。比较这三种品系动物Hp的定植量和病理组织学发现,Hp定植于C57BL/6小鼠的几乎全胃,而Wistar大鼠及BALB/c小鼠更多见于胃窦,胃体较少;C57BL/6小鼠Hp定植量高于其它两个品系的动物。病理反应也存在差异。感染Hp 24周后Wistar大鼠慢性活动性胃炎比C57BL/6小鼠要重,这提示不同品系的动物对Hp的定植及反应是有差异的。这种不同的反应性适合于Hp不同方面的研究,SS1 Hp在C57BL/6和BALB/c小鼠的高定植量有利于评价药物根除Hp的疗效,对Hp疫苗的抗原筛选及治疗性免疫的研究具有重要的应用价值;SS1Hp在Wistar大鼠中的长期定植及明显的炎症反应适宜于Hp致病性方面的研究,如Hp与慢性胃炎、消化性溃疡的关系,尤其是对Hp与胃癌关系的澄清具有重要作用,利用该模型进行Hp与胃癌关系的研究是我们下一步的工作。

参考文献

 1  陈湖, 曾志荣, 胡品津. 多聚合酶链式反应随机引物扩增的DNA多态指模技术在幽门螺杆菌菌株鉴别中的应用.现代消化病及内镜杂志,1996, 1:285-288.
 2 Lee A,Rourke JO,Corazon M,et al. A standardised mouse model of Helicobacter pylori infection.Introducing the sydney strain. Gastroenterology,1997;112:1386-1397.
 3 Sakagami T, Dixon M, Rourke JO, et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut,1996,39:639-648.
 4 Marchetti M, Arico B, Burroni D, et al. Development of a mouse model of Helicobacter pylori that mimics human disease. Science,1995,267:1655-1658.
 5 陈晶晶,姚楚铮,庄,等.幽门螺杆菌对大鼠的实验性感染.中华医学杂志,1991,71:590- 591.

幽门螺杆菌长期感染鼠腺胃模型的研究下载如图片无法显示或论文不完整,请联系qq752018766
设为首页 | 联系站长 | 友情链接 | 网站地图 |

copyright©751com.cn 辣文论文网 严禁转载
如果本毕业论文网损害了您的利益或者侵犯了您的权利,请及时联系,我们一定会及时改正。