脑源性神经营养因子在预缺血模型神经保护中的作用
【论文摘要】 目的 研究脑源性神经营养因子(BDNF)在预缺血模型中的表达水平及作用，以探讨缺血耐受形成的分子信号机制。方法 制备SD 大鼠大脑四动脉结扎模型及预缺血模型，采用免疫印迹、免疫沉淀等技术，检测各实验组中BDNF表达、其受体酪氨酸激酶受体B(TrkB)和下游蛋白胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化的水平变化。结果 预缺血组BDNF的表达、TrkB和ERK1/2磷酸化水平较缺血/再灌注组升高(P<0.05)，而TrkB受体的拮抗剂K252a可以降低其升高的激活水平(P<0.05)。结论 预缺血激活BDNF-TrkB- ERK1/2信号通路实现其神经保护作用。
【论文关键词】 脑源性神经营养因子;预缺血;缺血耐受
Abstract: Objective To investigate the expression level and the role of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in ischemic preconditioning (IP) model and the underlying molecular signaling mechanism of ischemic tolerance. Methods Ischemic preconditioning model was induced by the four-vessel occlusion in Sprague-Dawley rats. Immunoblotting and immunoprecipitation methods were employed to determine the variations in the expression level of BDNF， the phosphorylation levels of its receptor， tyrosine kinase receptor B (TrkB) and the downstream extracellular-signal-regulated kinase (ERK1/2). Results In the IP group， the levels of BDNF expression and TrkB and ERK1/2 phosphorylation increased (P<0.05)， as compared to the Ischemia/Reperfusion group， while the pretreatment with K252a， a TrkB receptor antagonist， reversed the preconditioning-induced increase in TrkB and ERK1/2 activation (P<0.05).Conclusion Ischemic preconditioning exerts the neuroprotective effect via the activation of BDNF-TrkB-ERK1/2 pathway.
Key words: brain-derived neurotrophic factor; ischemia preconditioning; ischemic tolerance
预先给予动物短时程全脑缺血刺激可对再次严重的缺血刺激发生耐受，从而明显减少海马神经元损伤。脑缺血耐受神经保护作用的分子信号机制还不很清楚。近年大量研究证明脑源性神经营养因子(BDNF) 对缺血后的大脑神经元有营养保护作用，并能促进损伤神经元的修复。BDNF受体即酪氨酸激酶受体B(TrkB) 可特异性地结合BDNF从而直接或间接触发信号传递的级联反应，如丝裂原应激活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B即PI-3K/PKB(Akt)信号通路等。在大多数情况下细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)通路激活是BDNF 发挥作用的优势途径。本研究采用免疫印迹、免疫沉淀方法检测大鼠全脑预缺血处理后BDNF表达、TrkB和下游蛋白激酶ERK1/2磷酸化的水平变化，研究BDNF-TrkB-ERK信号通路是否参与预缺血的神经保护作用，以及可能的临床意义。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 雄性SD大鼠，250～280 g，清洁级，由徐州医学院实验动物中心提供。实验动物随机分为5组(n=5)：假手术组(sham组)、缺血/再灌注组(I/R组)、预缺血处理组(P组)、预缺血给药组(P+K252a组)及预缺血溶剂对照组(P+DMSO组)。动物以20% 水合氯醛(300～350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉。I/R组于手术第2天动物清醒状态下结扎双侧颈总动脉，使全脑缺血6 min并复灌。P组、P+K252a组及P+DMSO组于手术第2天给予3 min缺血，3天后再给予6 min缺血并复灌。缺血前大鼠处于清醒状态，其生命体征完全正常。模型成功的标准是：缺血后30～60 s内翻正反射消失，四肢僵直，同时痛觉消失，双侧瞳孔散大等。sham组处理同实验组，但不结扎双侧颈总动脉。
1.2 试剂 p-ERK1/2兔多克隆抗体及TrkB拮抗剂K252a (Cell Signal公司 );抗ERK1/2多克隆抗体、 抗BDNF多克隆抗体、抗磷酸化酪氨酸p-tyr及抗TrkB多克隆抗体( Santa Cruz公司 ); 羊抗兔单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司 )。其他常用试剂均为国产分析纯。
1.3 给药 K252a以0.5 μg/μl的浓度溶解于1% dimethlysulfoxide (DMSO)，利用微量注射器通过侧脑室于预缺血前20 min给药(从前囟： 后开0.8 mm; 旁开1.5 mm; 深3.5 mm)，每只大鼠给药10 μl，10 min内注完。注射同体积的DMSO作为阴性对照。
1.4 检测样品的制备 大鼠缺血6 min再灌注10 min后，断头快速取脑，分离双侧海马，置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行：从液氮中取出海马加匀浆缓冲液，用Glas-col匀浆器高速匀浆(10 s×6次)，4℃下1 000 g离心15 min，小心移取上清液(主要为海马的胞质部分)备用。
1.5 蛋白含量测定 按Lowry等方法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。
1.6 免疫印迹(immunoblotting，IB) 等量蛋白样品经10%或15% SDS-聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，以湿转或半干转法电转移至NC膜上。转移后的NC膜经3%BSA封闭后加入不同的稀释后的一抗，4℃过夜。用洗涤液洗膜，加入相应的二抗，室温反应2 h。洗膜后以NBT/BCIP显色，结果以Image图像分析软件处理。
1.7 免疫沉淀(immunoprecipitation，IP) 取蛋白样品400 μg，加入320 μl 免疫沉淀缓冲液(IP buffer)。加DTT至终浓度为0.5 mmol/L，加入适量的一抗(抗TrkB抗体)，4 ℃反应12 h。再加入20 μl 蛋白A，4 ℃轻轻摇动2 h。 10 000 g×2 min离心，沉淀用IP buffer 洗3遍。加等体积2×SDS-PAGE样品处理液，沸水浴5 min，离心取上清，7.5% SDS-PAGE 分离，转移后的NC膜经3%BSA封闭后加入稀释后的抗磷酸化酪氨酸抗体，余步骤同方法1.5。
1.8 统计学处理 数据以均数±标准差(±s)表示，统计分析采用方差分析(ANOVA)，多个实验组与对照组比较用最小显著差法(LSD)，实验组之间比较采用q检验(Newman-Keuls test)，P<0.05为统计学有差异。
2 结 果
2.1 再灌注早期预缺血提高BDNF的表达 P组BDNF的表达水平较缺血/再灌注组明显升高(P<0.05)，见图1、表1。
图1 预缺血在再灌注早期对BDNF表达水平的影响表1 各组BDNF表达水平比较与I/R组比较：*P<0.05
2.2 TrkB拮抗剂K252a抑制预缺血诱导的TrkB和ERK1/2的激活P组再灌注10 min后，TrkB和ERK1/2的磷酸化水平较I/R组显著升高(P<0.05)，而K252a处理后两者的磷酸化水平都较P组有显著抑制(P<0.05)(图2、表2)。
图2 预缺血和K252a在再灌注早期对TrkB
及ERK1/2的激活的影响表2 各组蛋白磷酸化及表达水平比较P组与I/R组比较：*P<0.05;P+K252a组与P组比较：#P<0.05