镁合金基HA复合材料的生物相容性分析
0 引 言
镁合金良好的机械强度、低弹性模量及生物可降解性引起医学生物材料界的重视，具有很大的发展潜力[1]. 然而，镁合金降解速度快，在体内环境中未完成承力任务前就降解了，限制了他的应用。 通过镁合金表面改性，改善镁合金在人体体液环境中耐腐蚀性较差的问题[2-3],即可获得一种具有适宜降解速度且机械强度、弹性模量都比较好的生物材料。 羟基磷灰石（HA） 具有良好的生物相容性、生物活性及骨诱导能力，且耐腐蚀性较好，是一种理想的人工骨表面涂层材料[4]. 在镁合金表面涂覆一层羟基磷灰石，生成镁合金基HA 复合材料，该材料兼备了镁合金良好的机械性能、低弹性模量及生物可降解性，以及羟基磷灰石良好的生物相容性、生物活性及骨诱导能力，是一种 比 较 理 想 的 人 工 骨 材 料 或 人 工 骨 支 架材料[5-7].
目前通过电泳沉积法已成功的制备出镁合金基 HA 复合材料。 该复合材料的生物相容性[8-9]及生物活性[10-11],决定其能否作为人工骨材料长期存于体内并发挥功能与作用[12]. 为此，有必要验证镁合金基羟基 HA 复合材料的生物相容性与生物活性。 本研究采用动物体内埋植实验来研究镁合金基 HA 复合材料的生物相容性； 将制备好的镁合金基 HA 复合材料浸泡于 SBF（模拟体液） 中测试该材料的生物活性。http://www.751com.cn
1 材料与方法
1. 1 实验材料
1） 实验主要材料
采用电泳沉积法制备好的镁合金基 HA 复合材料； SD 大鼠 8 只，来源于南华大学动物实验中心。
2） 实验主要试剂
无水乙醇（≥99. 7%） 、7% 的水合氯醛、组织固定液（10% 的福尔马林中性固定液） 、去离子水、SBF 溶液。
3） 实验主要设备
自制 SD 大鼠实验手术台（含手术刀、手术针、手术缝合线、镊子、剪刀等） 、X 射线衍射仪（XD-3） 、组织切片机、生物电子显微镜（PH50） 、电子分析天平（DV214C） 、电热恒温箱（SA2-WD-350） 、超声波清洗器 （KQ-100B） 、JSM-6490LA 型扫描电子显微镜。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 种植体预处理
将制 备 好 的 镁 合 金 HA 复 合 材 料 试 样（2 mm ×2 mm ×1 mm） 进行修整； 采用 X 射线衍射仪对试样进行 XRD 分析，以验证 HA 涂层的制备情况，并排除种植体含其它杂质污染的可能。 在动物埋植实验前，先将种植体试样浸泡于无水乙醇溶液中 30 min 进行消毒处理，防止细菌感染而引发炎症反应。
1. 2. 2 动物埋植实验
1） 分组及对照设计
实验在南华大学动物实验中心进行。 选取 SD大鼠 8 只，体重约 200 g,雌雄各半。 将实验大鼠分成两组： （1） 种植体组： 将制备好的种植体材料适当修整，植入到大鼠左侧后肢肌肉内，并对植入物进行包埋定位后缝合。 （2） 对照组（无植入材料单纯的损伤组） : 将大鼠相对应的左侧后肢肌肉组织剪开一个小口，对伤口定位后进行缝合。
2） 外科手术
用无水乙醇对植入大鼠体内的种植体进行消毒灭菌处理后，选用 7% 的水合氯醛作为麻醉剂药品，使用剂量为 0. 005 mL/g 麻醉剂药品对动物进行一次给药静脉全麻。 全麻醉成功后，将大鼠仰卧固定在实验手术台上，取左侧后肢内侧肌肉组织为植入部位，并对植入部位表皮去毛，采用络合碘溶液进行常规手术消毒，铺无菌手术巾。 将表皮切开一道两厘米左右的口子，然后使用镊子找到肌肉组织，通过手术刀将肌肉组织切开一小口，然后将种植体埋入肌肉组织，使用手术针和手术缝合线将肌肉组织缝合进行包埋定位，定位后将大鼠的表皮伤口缝合。 术后将实验大鼠放入动物饲养箱，不限制动物的自由活动。
3） 组织学检测
手术后饲养一定的时间（分别为 2、3、4 周） ,采用 7%的水合氯醛作为麻醉剂药品静脉注射麻醉动物，然后采用气体栓塞法处死实验动物。 处死后立即取材，将含有植入物及其周围的肌肉组织切下后，装入盛有组织固定液溶液的塑料标本管内进行组织固定，3 d 后取出整个肌肉组织，并将包埋的植入物取出后对周围组织进行组织切片、HE 染色处理，并置于生物显微镜下观察。
1. 2. 3 SBF 浸泡实验
取镁合金基 HA 复合材料样片 （9 mm ×9 mm × 2 mm） ,由于样片两面都有涂层，为了避免造成混淆，选择涂层完好的一面作为实验面，而另一面去掉部分涂层露出镁合金基体作为对照面。 将样片清洗后恒温（37 ±1 ） ℃浸泡于 SBF 溶液中，浸泡四周后取实验样片清洗、风干，进行XRD 分析。
2 结果与讨论
2. 1 种植体的表征
在 X 射线衍射仪上分别对 HA 粉体、镁合金基及种植体材料进行衍射实验，通过衍射图谱的对照与分析，确定种植体的物相组成。 如图 1 是镁合金、羟基磷灰石（HA） 和种植体材料（HA/Mg 复合材料） XRD 衍射图谱对比分析图。 HA/Mg 复合材料与 HA 粉体的主要衍射峰能较好地相对应，且除镁合金衍射峰以外无其它的衍射峰存在，说明电泳沉积制备的 HA/Mg 复合材料表面涂层主要成分是 HA,且无其它的杂质存在。 电泳沉积没有导致 HA 晶相变化，还是单一的 HA 晶相。 同时各衍射峰在高度及宽度上有所差别，相比 HA 粉体，种植体所含的 HA 衍射峰高度较低、宽度较窄，表明种植体中 HA 的结晶度相对较低、总量相对较少。
采用日本 JSM-6490LA 型扫描电子显微镜对制备的沉积涂层进行扫描，采用电泳沉积法制备的涂层表面微观形貌如图 2 所示。 由图 2 可知，涂层由针状的 HA 颗粒紧密排列而成，致密均匀，无裂纹，并完全覆盖了镁合金基表面。 采用粘接拉伸法测得涂层与镁合金基的结合强度约为 4 MPa.
通过对电泳沉积工艺参数的优化及沉积涂层后续热处理，能够得到了涂层与基体结合强度良好、表面微观性能适中的 HA/Mg 复合材料。
2. 2 动物实验
实验鼠术后切口轻度红肿，无渗透，大约两周后伤口痊愈。 种植体埋入大鼠肌肉组织后，分别以术后 2 周、3 周及 4 周分批处死实验大鼠，解剖发现种植体周围软组织均无明显的充血、积液、变性、坏死及化脓等表现。 术后有轻微的炎症反应，存在少量的炎细胞浸润； 随着术后时间的延长，纤文结缔组织增生明显，逐渐形成纤文囊并包裹着种植体，周围组织浸润的淋巴细胞、巨核细胞等炎细胞逐渐减少。 这表明了 HA/Mg 复合材料引起机体的炎症反应、免疫反应不明显，无毒性，与机体相容性较好。
种植体不同埋植时间周围组织切片如图 3 所示，图 3a 为实验对照组，图 3b、3c、3d 分别为种植体埋入 2 周、3 周以及 4 周的组织切片图。 相比对照组，图 3b 周围组织有少量结缔组织增生及新生血管的形成，并有较多的淋巴细胞、巨核细胞等炎细胞的浸润，分布均匀； 图 3c 与图 3b 相比，周围组织淋巴细胞、巨核细胞等炎细胞浸润相对较少，结缔组织增生明显，但是没有形成纤文囊； 图 3d中埋植物周围未见大量多核巨细胞及中性粒细胞等炎细胞的浸润，且有大量的纤文结缔组织增生，纤文结缔组织包裹种植体形成纤文囊。 由于取下种植体时，依附在种植体表面的纤文组织被撕下，图片 3d 中纤文囊局部位置无纤文结缔组织而形成光滑的曲面。
对取出的种植体进行肉眼观察及称重测量，发现种植体几乎没有发生降解且重量变化幅度小，这说明了种植体表面 HA 涂层在一定的时间内能阻缓镁合金基体的腐蚀。
2. 3 SBF 实验
HA / Mg 复合材料浸泡前表面 HA 涂层为针状的 HA 颗粒紧密排列，且 HA 涂层表面无晶体沉积。
浸泡于 SBF 溶液四周后，镁合金基 HA 复合材料表面不但没有被腐蚀，其表面涂层厚度反而增加，有一层白色覆盖物沉积于涂层表面。 图4 为 HA/Mg 复合材料浸泡于 SBF 溶液四周后的 SEM 图，通过图4 观察可知，排列紧密的针状形的 HA 表面有一层白色的晶体覆盖，并形成块状的覆盖物。
经如图 5 的 XRD 分析，该覆盖物具有磷灰石晶相，相比浸泡前，浸泡后的涂层中所含的磷灰石的 XRD 衍射峰强度增加，而镁合金 XRD 衍射峰强度降低。 表明了浸泡后的复合材料所含磷灰石成分增加，羟基磷灰石（HA） 能诱导磷灰石的形成。 然而对照面去掉涂层部分的地方腐蚀相当严重，镁合金基底基本完全被腐蚀了。 说明了羟基磷灰石（HA） 在体液环境耐腐性较好，能减缓镁合金在体液环境中的腐蚀速率。
3 结 论
动物埋植实验表明电泳沉积法制备的镁合金基 HA 复合材料引起机体免疫反应不明显，无细胞毒性，不产生炎症反应，具有良好的生物相容性。 SBF 浸泡实验表明镁合金基 HA 复合材料能够促进钙的沉积，诱导类骨磷灰石的形成，具有良好的生物活性。 动物埋植实验和 SBF 浸泡实验同时验证了镁合金基 HA 复合材料具有良好的耐腐蚀性，说明了 HA 能减缓镁合金的腐蚀速率，使得镁合金在预定的服役期内满足机械性能要求。
参考文献：
[1]曾荣昌，孔令鸿，陈君，等。 医用镁合金表面改性研究进展[J]. 中国有色金属学报，2011,21（1） : 35-43.
[2]郭洁，唐舟，朱伟，等。 表面改性在医用镁及镁合金材料研究中的应用[J]. 生物骨科材料与临床研究，2009,6（4） : 38-41.
[3]张晓，梁敏洁，廖海洪，等。 生物医用镁合金腐蚀与防护的研究进展[J]. 热加工工艺，2014,43（8） : 9-12.
[4]李俊杰，姚晖，陈亦平，等。 微纳米羟基磷灰石及其复合材 料 研 究 进 展[J]. 化 工 进 展，2006,25 （6） :651-657.