釉成熟蛋白多肽多克隆抗体的制备及其功能
釉成熟蛋白（amelotin）是一种在人的成釉细胞特异性表达的蛋白，在小鼠、猪、大鼠等物种中高度保守，相对分子质量（Mr）21 000 ~ 38 000[1 -3].小鼠amelotin 全长 cDNA 序列为 1022 bp,编码 213 个氨基酸，富含亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸残基，与人的amelotin 高度同源[4 - 6].Amelotin 家族成员在 5'端均具有 16 个氨基酸的信号肽序列[7],因而它们可能是一种分泌性的蛋白。研究发现，amelotin 参与釉质的发育、成熟过程，其结构和功能的改变与釉质发育相关疾病有密切关系[8 -10].国外公司有商品化的抗体出售，价格昂贵，并且特异性不强，灵敏度不高，无法满足目前的实验要求。本课题组曾根据 amelotin的全长氨基酸序列，应用构建重组融合蛋白的方法制备了 amelotin 多克隆抗体[11],但是该方法制备的抗体的特异性及效价已经不足以满足我们的后续实验需要； 并且该方法制备抗体的过程程序繁琐，耗时较长，影响实验进程。为进一步探讨 amelotin 在釉质的发育、成熟过程中的功能，我们应用设计合成多肽的方法制备了效价高、特异性好的 amelotin 多肽多克隆抗体，其识别抗原表位的能力更强。
1 材料和方法
1. 1 材料
完全 Freund 佐剂（complete Freund's adjuvant,CFA）、不完全 Freund 佐剂（incomplete Freund's adjuvant,IFA）、丙烯酰胺购自 Sigma 公司； 牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA） 、多聚赖氨酸、辣根过氧化物酶（ horseradish peroxidase,HRP）标记的山羊抗兔 IgG、ABC 免疫组织化学检测试剂盒、DAB 显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司； 放射免疫沉淀技术（radioimmunoprecipitation assay,RIPA）裂解液、二辛可宁酸（bicinchonininc acid,BCA）蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司； 聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF） 膜购自 Roche 公司； ECL Plus 化学发光试剂盒购自Santa Cruz 公司。出生后 3、7 d 昆明小鼠各 2 只，新西兰大白兔 2 只（3 kg/只）由潍坊医学院实验动物中心提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 Amelotin 抗原表位的分析 由 GenBank 蛋白质数据库中获取 amelotin 蛋白氨基酸序列，利用在线蛋白分析工具ANTHEPROT 5. 0、DNA Star 等进行亲水性 （ hydrophilicity） 、表面可及性（surface accessibility）、柔韧性（flexicity）、抗原性和二级结构等参数的综合预测，并应用 Blast 程序进行同源性和保守性分析，最终确定需要合成的多肽序列。
1. 2. 2 兔抗 amelotin 多肽抗体的制备 Amelotin 多肽由武汉三鹰生物有限公司合成，将合成的 amelotin 多肽肽链与钥孔戚血蓝素（keyhole limpet hemacyanin,KLH）采用戊二醛连接法进行交联[3],形成 amelotin-KLH 偶联物，此大分子物质即为我们之后免疫动物所用的半抗原。取 2 mg（1000 μL）的多肽 KLH 偶联物与等体积的 CFA 混合，充分乳化。在新西兰大白兔背部选取 4 个注射点进行注射，每点约 250 μL.4 周后加强免疫 1 次，用 IFA 将剂量减半的多肽偶联抗原充分乳化后进行背部注射。之后 2 周加强免疫 1 次。兔耳缘静脉采血进行抗血清效价测定，达理想效价后，再次注射无佐剂的amelotin-KLH 抗原 250 μL / 点，加强免疫 1 次，3 d 后颈动脉放血，收集并分离血清，无菌分装，-80℃保存备用。
1. 2. 3 Amelotin 多肽抗体的纯化 采用亲和层析法进行多肽抗体纯化。首先将 1 mg amelotin 多肽与溴化氰（cyanogenbromide,CNBr）活化后的 Sepharose 4B 偶联，制备多肽亲和层析凝胶。取 20 mL 兔抗 amelotin 血清与 1. 6 mL 多肽偶联凝胶，4℃旋转混合 6 h,加入层析柱； PBS 冲洗平衡凝胶，之后加入 1 mL 0. 1 mol/L pH2. 9 甘氨酸缓冲液洗脱 10 次； 用10 支预先加入 100 μL pH7. 5 Tris-HCl 缓冲液的收集管收集洗脱液。为确保实验效果，操作均在 4℃下进行。通过 BCA蛋白浓度测定试剂盒对蛋白质进行定量，SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色了解纯化效果。
1. 2. 4 间接 ELISA 测定抗血清效价 以 1 mg / L 多肽 KLH 偶联物 100 μL /孔包被96 孔酶标板，4℃过夜。滴加5 g/L BSA（160μL/孔） 37℃封闭 2 h.加入稀释的纯化多肽抗体、免抗血清或非免疫血清（100μL/孔），37℃孵育 1 h.滴加 HRP 标记的山羊抗兔 IgG（1∶3000），37℃孵育1 h; TMB 显色液室温避光显色15 min,2 mol/L 硫酸终止显色，测定样品在450 nm 的吸光度（A）值。以 A抗血清/ A阴性> 2. 1 作为阳性判断的依据1. 2. 5 Western blot 法鉴定 amelotin 多肽抗体的特异性 利用 RIPA 裂解液试剂盒制备成釉细胞总蛋白，用 2 × SDS 上样缓冲液悬浮大肠杆菌中表达的小鼠 amelotin 融合蛋白（潍坊医学院口腔医学研究所实验室制备储存）、含有活性 amelotin的小鼠成釉细胞蛋白裂解液及 KLH,95℃加热7 min 后，冰上冷却 10 min.以 40 μg/孔的量进行上样，经 SDS-PAGE 分离蛋白质，电转至 PVDF 膜上。经50 g/L 脱脂奶粉室温封闭1 h后，滴加1∶1000 稀释的纯化多肽抗体，室温孵育2 h.洗涤后，加入 HRP 标记的山羊抗兔 IgG（1∶5000），室温孵育 1 h.ECLPlus 化学发光试剂盒处理 5 min,于暗室曝光到 X 光胶片上。
1. 2. 6 制备的 amelotin 多肽抗体的应用 免疫组织化学染色观察 amelotin 在小鼠下颌中的表达。取出生后 3、7 d 昆明小鼠下颌骨组织，置于 100 mL/L 甲醛中，4℃ 固定 16 h; 经100 g / L EDTA 溶液 4℃ 脱钙 6 d,常规制作石蜡切片。组织切片脱蜡入水，将切片于 pH 6. 0 柠檬酸钠缓冲液中，95℃40 min进行抗原修复； 50 mL / L H2O2甲醇中 15 min 去除内源性过氧化物酶活性，滴加1∶50 的正常羊血清 37℃封闭 30 min;滴加纯化兔抗 amelotin 多肽抗体（1∶50），同时以商品化的amelotin 抗体为对照，以非免疫血清为阴性对照，4℃ 孵育过夜，ABC 免疫组织化学检测试剂盒进行检测。DAB 显色，中性树胶封片，显微镜下观察结果，以棕黄色染色判定为阳性结果。
2 结果
2. 1 Amelotin 的氨基酸序列分析
用在线蛋白工具对 amelotin 的蛋白质氨基酸序列进行分析，以避免制备的多肽抗体与其他同源蛋白之间的交叉反应，提高抗体的特异性。针对蛋白质的亲水性、柔韧性、二级结构、抗原性及表面可及性等参数预测结果进行综合研究，确定 amelotin 的第197 ~ 210 位的 14 个氨基酸 （ ATHTTEGTTIDPPN） 为需要合成的多肽序列（图 1）。
2. 2 Amelotin 抗血清效价的测定及多肽抗体的纯化
利用 amelotin 多肽 KLH 偶联物为抗原免疫新西兰大白兔，获得兔抗血清，亲和层析法对 amelotin 抗血清进行纯化，经 SDS-PAGE 后条带单一，BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测免疫 2 只大白兔获得的抗体的浓度分别为 300 μg/mL 和 450 μg/mL,选用高浓度抗体进行下一步实验（图 2）。间接 ELISA 检测表明免疫获得的抗血清的效价可达到 1∶100 000,纯化后的 amelotin 抗体效价可达 1∶1 000 000（图 3）。
2. 3 Amelotin 多肽抗体的特异性鉴定以制备的小鼠 amelotin 大肠杆菌融合表达蛋白、含有活性 amelotin 的小鼠成釉细胞蛋白裂解液作为抗原，amelotin 多肽抗体为一抗进行 Western blot 法检测，条带 1 ~2 显示多肽抗体与 amelotin 大肠杆菌融合表达蛋白相互作用，出现 1 条清晰的带，与融合表达蛋白 amelotin 的 Mr大小相符； 条带3 ~5 显示与活性 amelotin 的成釉细胞蛋白裂解液相互作用，出现1 条清晰的目的条带，与活性 amelotin 大小相符； 而与 KLH 相互作用则无条带出现（图 4）。说明所制备的抗体既可识别含有半抗原的抗原表位蛋白，又能与天然的 amelotin 蛋白结合。
2. 4 制备的多肽抗体检测 amelotin 在小鼠下颌组织的表达
用纯化的 amelotin 多肽抗体对 3、7 d 小鼠的下颌组织进行免疫组织化学染色，在 3、7 d 小鼠的磨牙釉质全层观察到强阳性信号带（图 5A、B）。商品化 amelotin 抗体组仅在 7 d 小鼠磨牙釉质见到较弱的阳性信号，以非免疫血清代替一抗组未检测到amelotin阳性表达信号（ 图 5C、D） .另外，在 7 d 小鼠下颌下腺的导管上皮细胞的胞质中还观察到amelotin的表达，而腺泡细胞则呈阴性反应，但 3 d 小鼠的下颌下腺中未见 amelotin 的表达（图 5E、F）。
3 讨论
Amelotin 是最近发现的一种新的与牙釉质的发育成熟有关的釉质基质蛋白，它定位于人的 4 号染色体 q13. 3 区域与釉蛋白（enamelin） 和成釉蛋白（ameloblastin） 紧密相连[12 - 14].Amelotin 在釉质分泌阶段未见明显表达，随着釉质发育成熟 amelotin 在成釉细胞中的表达逐渐增加，可见此蛋白可能与牙釉质矿化过程有关联[15 - 16].遗传性釉质发育不全（amelogenesis imperfects,AI ）的致病基因定位于4q11-4q21 区域，而 amelotin 可能与 AI 的发生密切相关[17 -18].我们研究小组在 2009 年根据 amelotin 的全长氨基酸序列，构建了 pET32a-Amelotin 原核融合表达载体，根据重组融合蛋白制备了 amelotin 多克隆抗体[11],该方法制备的抗体特异性和效价已经无法满足我们的实验要求，为更好地研究 amelotin 的生理及病理特性，我们设计合成了 amelotin 多肽，之后制备了 amelotin 多肽多克隆抗体，经实验证明该抗体特异性强、灵敏度高，该方法的优势在于使用少量的多肽抗原即可获得大量质量均一的特异性 amelotin 蛋白，经济简单。
通过对 amelotin 氨基酸序列的亲水性、表面可及性、柔韧性、二级结构及抗原性等参数应用软件综合评价预测结果的分析[18],我们最终确定 amelotin 的第 197 ~210 位区域 14 个氨基酸作为其抗原决定簇。
同时在蛋白质数据库中进行同源性检索，验证其特异性。为增加合成的小分子多肽的免疫原性，我们设计多肽时在其 C 端加 1 个半胱氨酸，并与载体KLH 偶联。
通过 ELISA 和 Western blot 实验，我们发现制备的 amelotin 多肽 KLH 具有很好的免疫原性，获得的抗血清具有较高的效价，可达到1∶1 000 000,与我们以前制备的 amelotin 效价 1∶12 800 相比[11],抗体效价明显提高，能够满足后续的实验应用。并且制备的 amelotin 多肽抗体既能特异识别融合的蛋白，又能识别天然构象的蛋白，这表明我们利用所设计和合成的多肽制备的抗体是成功的。利用制备的多肽抗体进行的免疫组织化学染色，结果显示 amelotin 在出生 3、7 d 小鼠的磨牙牙釉质中高表达，与我们之前利用重组融合蛋白的方法制备 amelotin 抗体的检测结果一致[11],与商品化的 amelotin 抗体相比，特异性更高。另外，还在7 d 小鼠下颌下腺的导管上皮细胞的胞质中观察到 amelotin 的表达，但 3 d 小鼠中未见表达。作为参与釉质发育成熟的特异性蛋白，为何在腺体中有所表达，并且表达量呈现时空特异性，是否 amelotin 也与腺体的发生分化及发育异常有关，还有待于进一步研究。以上实验证明我们成功设计和合成了 amelotin 多肽片段，制备的多肽抗体效价高、特异性好，符合实验要求。Amelotin 合成多肽及其抗体的成功制备，为下一步进行 amelotin 的分子功能及蛋白质组学研究打下很好的基础。http://www.751com.cn/
参考文献：
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[3]Sawada T,Yamazaki T,Shibayama K,et al. Expression and localizationof laminin 5,laminin 10,type Ⅳ collagen,and amelotin in adultmurine gingiva[J]. J Mol Histol,2014,45（3）： 293 -302.