2.2.5 载体连接、转化、筛选 15
2.2.6 双酶切 16
2.2.7 序列分析 16
3 结果与分析 17
3.1透明质酸酶编码基因的克隆 17
3.1.1 PCR扩增马疫链球菌ATCC43079菌中透明质酸酶的结果 17
3.1.2 重组质粒pMD18T-HAase的构建 18
3.1.3 pMD18T-HAase质粒的验证结果 19
3.2透明质酸酶编码基因序列分析 20
3.2.1 HAase基因核酸序列分析 21
3.2.2 HAase基因推导的氨基酸序列分析 21
3.2.3 蛋白质结构分析 23
4 讨论与结论 27
4.1 讨论 27
4.2 结论 27
致谢 29
参考文献 30
附件1 HAase基因序列 32
附件2 HAase氨基酸序列 34
1 前言
1.1 透明质酸酶概述
透明质酸酶(hyaluronidase, HAase)是一类在动物组织和微生物中广泛存在的细胞外降解酶,是对催化降解透明质酸酶的通称。它可以特异性地断开透明质酸(hyaluronic acid,HA)中的β-N-乙酰氨基葡萄糖胺与D-葡糖醛酸盐之间的1,4-糖苷键,将其解聚和水解成低相对分子质量(Mr)HA或寡糖,降低HA的黏滞性和起到润滑作用,降低体内透明质酸的活性,从而提高组织中液体渗透能力[1]。
1.1.1 透明质酸酶的发现及分类
1928年Duran-Reynals在研究哺乳动物睾丸及其他组织提取物时发现了一种“扩散因子”,可以促进皮下注射的疫苗、染料、毒素等更好地扩散;1937年Meyer发现Ⅱ型肺炎链球菌可降解透明质酸(hyaluronic acid,HA)。随后,该“扩散因子” 也被鉴定是透明质酸酶,这两项研究使得透明质酸酶的发现成为可能[2]。此后研究发现,在蛇毒、蜂毒、蝎毒以及蜘蛛等的毒液中都存在透明质酸酶。此外,一些细菌、真菌以及非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物等也产生透明质酸酶。透明质酸酶分布虽广,但在过去很长一段时间里由于分离纯化困难并没有得到很好地研究,是一类被忽视的酶。最近十几年来,人们对HA和透明质酸酶显示出了浓厚的兴趣,试图探求它们在众多生物学过程中的作用。
透明质酸酶是一种偏酸性蛋白酶,根据氨基酸序列的同源性,HAase可分为两大类:真核生物HAase和原核生物HAase。根据底物特异性和作用机制分为三大类:哺乳动物类透明质酸酶,细菌透明质酸酶,来自水蛭、其它寄生虫和甲壳类动物的透明质酸酶。1971年,Meyer根据HAase的作用机制与底物特异性,将其分为以下3类(表1-1)[3]。
表1-1 HAase的分类
Table 1-1 Classification of hyaluronidase
分类 来源 活性 作用底物 终产物
透明质酸-4-溶菌酶(EC 3.2.1.35) 睾丸,蜂毒,溶酶体 作用于β-1,4糖苷键,转糖苷酶 HA,软骨素,硫酸软骨素,硫酸皮肤素 四糖
透明质酸-3-溶菌酶(EC 3.2.1.36) 水蛭,钩虫唾液腺 作用于β-1,3糖苷键 特异性降解HA 四糖,751糖
透明质酸裂解酶 (EC 4.2.2.1) 微生物,如链球菌、梭菌等 作用于β-1,4糖苷键,消去机制 HA,软骨素 不饱和葡糖醛酸-N-乙酰己糖胺 透明质酸酶编码基因的克隆及序列分析(2):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_11608.html