以EIN2基因的特异性引物为测序引物，将重组质粒送至金斯瑞生物科技有限公司进行测序鉴定。
1.2.5 质粒pYY13单酶切及切胶回收纯化
质粒pYY13用PstⅠ进行单酶切处理，37℃水浴2h，65℃水浴20min将酶灭活。电泳后采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收质粒。
1.2.6 质粒pYY13与目的基因EIN2的连接反应
将PCR产物和单酶切后的pYY13经SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化后，对目的基因和质粒进行T4 DNA聚合酶处理，将目的基因连接上接头(dATP)n，pYY13连上接头(dTTP)n。反应条件：65℃ 30min，75℃ 20min。PCR产物连接反应体系：纯化后的PCR产物10μL，dATP 2μL，T4 DNA polymerase 1μL，10×T4 DNA polymerase buffer 4μL，加双蒸水至20μL；单酶切质粒连接反应体系：单酶切过的pYY13 10μL，dTTP 2μL，T4 DNA polymerase 1μL，10×T4 DNA polymerase buffer 4μL，加双蒸水至20μL。
分别取上述处理过的目的基因5μL和质粒1μL混合，22℃水浴10min，再75℃水浴2min，完成连接反应。
1.2.7 感受态细胞的制备和目的基因的转化
操作同1.2.3。
1.2.8 重组载体pYY13-EIN2的检测与鉴定
重组载体pYY13-EIN2的PCR鉴定和测序鉴定分别按照1.2.4的操作进行。
2. 结果与分析
2.1 番茄总RNA的提取与cDNA的扩增
如图所示，以番茄为材料提取其总RNA，得到较高质量的RNA（图1）。然后以总RNA为模板进行RT-PCR扩增其cDNA（图2）。
图1 番茄总RNA
图2 cDNA的电泳结果
注：M：DL5000 Marker；1：cDNA产物
2.2 目的基因的克隆
以cDNA为模板，用EIN2的特异引物进行PCR扩增目的基因（图3），其条带大小约为400bp，和预期结果一致。
图3 EIN2产物的电泳结果
注：M：DL2000 Marker；1-3：EIN2 PCR产物
2.3 重组载体pMD18-T-EIN2的PCR检测结果
分别提取重组载体进行PCR验证，同时以纯水作为阴性对照。以重组载体为模板扩增出约400bp的条带，而阴性对照未扩增出任何条带（图4）。
图4 pMD18-T-EIN2重组质粒的PCR检测
注：M：DL5000 Marker；1：重组质粒pMD18-T-EIN2；2：阴性对照
2.4 重组载体pMD18-T-EIN2的测序结果
将重组的阳性质粒送至金斯瑞生物科技有限公司进行测序，通过单向测序结果证实，目的基因EIN2成功插入到pMD18-T载体中，说明重组载体构建准确无误（图5）。
图5 pMD18T-EIN2重组阳性质粒的部分测序结果
2.5 pYY13质粒单酶切
由于pYY13质粒有两个PstⅠ酶切位点，经酶切反应后得到两条带，较小的那条带是位于两个PstⅠ酶切位点之间的一段自杀基因（ccdB基因）序列（图6），切胶回收较大的那条带。
图6 pYY13单酶切电泳图
注：M：DL5000 Marker；1-2：未经单酶切处理的pYY13；3-4：pYY13单酶切产物
2.6 重组载体pYY13-EIN2的PCR检测结果
提取重组质粒和空质粒pYY13，分别以之为模板进行PCR扩增。以重组载体为模板扩增出约400bp的条带，而空质粒未扩增出任何条带（图7）。
图7 pYY13-EIN2重组质粒的PCR检测
注：M：DL5000 Marker；1-2：重组质粒pYY13-EIN2；3：pYY13空载对照
2.7 重组载体pYY13-EIN2的测序结果
将重组的阳性质粒送至金斯瑞生物科技有限公司进行测序，通过单向测序结果证实，目的基因EIN2成功插入到pYY13载体中，说明VIGS载体构建准确无误（图8）。
图8 pYY13-EIN2重组阳性质粒的部分测序结果
3. 讨论
本研究所用的病毒载体为烟草脆裂病毒载体pYY13，经pYY12和pYL170改造而成。该质粒含有两个接头，有利于外源基因的插入。并且两个接头之间被插入了一个自杀基因（ccdB基因），含这种基因的载体或者质粒只能在特定的菌株（DB3.1）中存活，不能够在大肠杆菌DH5α中存活，利用这一特性，可以在一定程度上避免假阳性现象，有利于高效回收正确的阳性克隆[14]。TRV-VIGS载体具有插入外源基因长（高达1kb以上）、持久性长、诱导基因沉默的效率高、可侵染花和分生组织等器官以及引起宿主温和病症等优点，已经成为病毒诱导的基因沉默的主要载体[15-16]。 番茄LeEIN2基因的克隆与沉默载体的构建(3):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_1496.html