1.4.1疫苗开发    8
1.4.2蛋白质文库与肽文库的筛选    8
1.4.3全细胞催化剂    8
1.4.4其他应用    9
1.5存在的问题及展望    9
1.5.1透明质酸酶相关问题    9
1.5.2细菌表面展示技术的局限性    9
1.6本课题的研究目的和意义    10
1.6.1研究的目的    10
1.6.2研究的意义    10
2实验材料与仪器设备    11
2.1实验材料    11
2.1.1菌株和质粒    11
2.1.2培养基及其制备    12
2.1.3主要生物学试剂    13
2.1.4质粒、总DNA提取，质粒转化所需试剂    13
2.1.5琼脂糖凝胶电泳所需试剂    13
2.1.6蛋白质的SDS-PAGE电泳所需试剂    13
2.1.7材料及来源    14
2.2主要仪器和设备    15
3实验操作方法    15
3.1菌种活化（马疫链球菌ATCC43079)    15
3.2 DNA相关操作    15
3.2.1 马疫链球菌细菌基因组提取    15
3.2.2 大肠杆菌质粒的提取    16
3.2.3 PCR扩增目的基因片段    17
3.2.4将目的基因连接到载体上    18
3.3重组质粒的转化和转化子的筛选鉴定    19
3.3.1将连接好目的基因的载体转入大肠杆菌    19
3.3.2大肠杆菌转化子的筛选鉴定    20
3.3.3回收目的片段、酶切验证    21
3.3.4转化入大肠杆菌BL21菌株，并验证连接效果    22
3.4通过NCBI进行序列同源性比对    22
3.5验证构建好的载体的表达情况    22
3.5.1聚丙烯酰胺凝胶电泳验证(蛋白质的SDS-PAGE电泳)    22
4结果与分析    25
4.1马疫链球菌透明质酸酶基因的抽提及扩增    25
4.2 PMD18-T-HAase重组质粒的构建    25
4.3 连接效果验证    26
4.4重组质粒的验证    27
4.5 HAase表面展示重组质粒的构建    27
4.5.1连接，转化，菌落筛选    28
4.5.2质粒抽提及电泳验证    28
4.5.3酶切验证    29
4.6同源性比对验证    30
4.7融合蛋白InaQ-N-HAase的表达    30
5讨论    30
5.1 pMD18-T载体使用过程中应注意的地方    30
5.2酶切过程遇到的问题分析    31
 
5.3提取质粒过程中遇到的问题    31
5.4琼脂糖凝胶电泳出现的问题分析与讨论    32
5.5 SDS-PAGE注意事项    32
6结论    32
7致谢    33
8参考文献    34
 1 前言
1.1 透明质酸酶的概述
 透明质酸酶（hyaluronidase，HAase）又称为玻璃酸酶，是对催化降解透明质酸酶的通称。两项研究导致了透明质酸酶的发现，一是1928年Duran．Reynals在研究哺乳动物睾丸及其他组织提取物时发现了一种“扩散因子”，可以促进皮下注射的疫苗、染料、毒素等更好地扩散。二是1937年Meyer发现Ⅱ型肺炎链球菌可降解透明质酸(hyaluronic acid，HA)[2]。随后，前面提到的“扩散因子” 也被鉴定是透明质酸酶。此后，人们在蛇毒、蜂毒、蝎毒以及蜘蛛等的毒液中都检测到了透明质酸酶。在人体组织及体液中也发现广泛存在着透明质酸酶。此外，一些细菌、真菌以及非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物等也产生透明质酸酶。透明质酸酶分布虽广，但在过去很长一段时间里由于分离纯化困难而且似乎研究意义不大，并没有得到很好地研究，是一类被忽视的酶。最近十几年来，人们对HA和透明质酸酶显示出了浓厚的兴趣，试图探求它们在众多生物学过程中的作用。 透明质酸酶大肠杆菌表面展示体系的构建(2):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_17805.html