2.2.1 总RNA提取 6
2.2.2 cDNA合成 . 7
2.2.3 实时荧光定量 PCR .. 7
2.2.4 主茎节数性状数据分析 8
2.2.5 候选基因同源序列分析 8
3 结果与分析 . 8
3.1 主茎节数遗传分析 8
3.1.1 F2群体主茎节数描述性统计及次数分布 8
3.1.2 主茎节数的遗传分析 . 9
3.2 候选基因表达分析 . 10
3.3 Glyma.13G233600 基因功能预测 12
4 讨论 .. 13
4.1 主茎节数遗传模型及应用价值 .. 13
4.2 大豆主茎节数的候选基因分析 .. 13
致谢 14
参考文献 . 14
1 引言 大豆是重要的粮食作物和油料作物，在世界各国广泛种植。为实现大豆高产稳产的育种目标，育种家提出大豆“理想株型”的概念。主茎节数是构成大豆株型的重要性状之一，大豆为节上结实，所以增加主茎节数对于提高单株结荚数至关重要。多数研究及育种实践表明主茎节数与产量显著正相关[1]。一般来说，增加主茎节数、分枝数，花序数就会相应增加，从而使单株荚数增加、产量提高，因此，许多育种工作者对该性状十分重视[2]。近年来，随着分子标记技术发展，使得对大豆主茎节数在分子水平上进行遗传改良研究成为可能。探索大豆主茎节数的遗传规律，对大豆主茎节数相关候选基因进行分析，可为大豆主茎节数基因克隆发展奠定基础、为“理想株型”大豆新品种选育提供理论依据。 1.1 大豆主要株型性状及遗传育种研究进展 大豆产量受多种因素影响，其中株型性状在产量形成过程中起重要作用。理想的大豆株型可增强抗倒伏能力；适度增加群体密度、调节叶面积指数，可以提高光能利用率达到增产目的。大豆株型性状主要涉及到根、茎、叶及花等器官特性，其中茎秆是最重要的株型性状。 1.1.1 根部性状研究 根系是植物吸收水分、矿物质，固定支撑地上部分的重要器官，在作物的产量和逆境胁迫中有着重要作用[3-6]。大豆为直根系，呈钟罩型，分为主根、侧根，根部着生根瘤。探索大豆根系的特点及其与逆境环境的关系，通过对根系性状进行分子遗传研究，可为大豆品种育种改良提供方向。研究表明，在不同的条件下，大豆根系性状表现相对稳定，受多基因控制，具有较高遗传率[7-8]。梁慧珍等研究报道，大豆主根长受 3 对等效主基因控制，侧根数受 2对重叠作用主基因控制，根重和根体积受 4对等效主基因控制，且这些性状均能检测到多基因效应[9]。周蓉等研究发现，在 8个染色体上检测到 20个根系及相关性状的 QTL(Quantitative Trait Locus)位点，其中9个主效 QTL位于第 11和第14染色体上，表型贡献率在 10.5%~26.1%之间，且部分 QTL与地上器官部分性状QTL 处于相同位置，QTL 共位性和形态性状表型相关分析结果一致，反映出地上部性状和根系性状之间存在一定的关联[10]。 1.1.2 叶片形态及遗传 叶片在植物株型构造中也占有重要地位。绿色植物叶片可以进行光合作用将光能转化为体内有机营养物中的化学能，固定二氧化碳形成有机养料，供给植物自身生长发育和为其他生物提供食物养料；同时，叶片进行蒸腾作用，产生蒸腾拉力促进根部吸收无机盐及降低叶温避免高温灼伤。大豆为三出复叶，围绕叶片也展开了大量育种改良研究。叶形是叶片重要特性之一，单叶多呈卵圆形，也有狭长的披针形[11]，Dinkins 等根据叶形指数(叶长/叶宽)范围将叶形分为三类：1.15~1.54 为宽叶，1.54~1.92 为中间型，2.22~3.13 为窄叶[12]。叶片狭窄，植株群体结构疏朗，透光性好，底层叶片有更高的光合效率[13]，这对构建大豆理想株型具有重要作用。早在 1973 年，Caldwell 已经发现，Ln 基因是一个经典的叶形调控位点[14]，多数研究也通过图位克隆和关联分析克隆到该基因[15-16]；陈磊对其进行功能验证分析，发现 Ln 编码一个带有 EAR 抑制性结构域的C2H2 型转录因子，作为上游调控因子调节下游众多转录因子相关基因的表达情况，与拟南芥中JAG类基因在基因表达调控网络中的作用相似，而且该位点存在可变剪接，进一步增加该基因的多效性[17]。研究人员还发现了一些叶型突变体。赵团结等报道了一个叶、花形态异常，雌性不育突变体 NJS-10H[18]；宋晓峰对荷豆 12 经 γ 射线诱导产生的皱叶突变体进行研究，认为 Glyma.07g028600 基因经影响植物角质层发育从而对叶片生长产生作用[19]。 1.1.3 茎秆相关性状研究进展 茎秆在植物生长过程中，输送水分和营养物质，支撑叶片、花与果实，直接决定各器官的空间分布状态，是作物品种株型育种改良中最重要的农艺性状[20]。该性状包括了茎秆的高度、韧性、形状、节间数及分枝的多少等等，与作物的抗倒伏性密切相关[21]。大豆根据茎秆形态差异，可分为直立型、半直立型、蔓生型三种。Cooper 等认为，倒伏是影响大豆高产的主要障碍[22]，适宜的株高加上粗壮韧性好的茎秆能有效降低大豆倒伏性。近年来，模式植物发育分子生物学研究已克隆出一批株型性状基因，为通过分子手段去设计和改造作物株型提供了可能，大豆中的相关研究也得到了发展。Takashi 等利用由两个分枝数有差异的大豆品种作为亲本衍生出的 172 个 RILs 进行研究，定位出 5个与分枝数相关的QTLs 位点：qBr1~qBr5，且 qBr1、qBr2分别位于大豆熟期基因位点E1、E3旁侧，因此成熟期可能对分枝数产生影响[23]；Chen 等3年内，通过对 Zhongdou No.29×Zhongdou No.32 形成的RIL群体研究表明，主茎强度、直径、节数和根干重四个农艺性状显著正相关，而位于 A2 连锁群上 8 个多效特异性 QTL 中 2 个 QTL与该四个性状相关联[24]。蒋春志等由 148 个 F9重组自交系构建出的连锁图谱，对品质性状、产量性状进行调查和 QTL 分析，得出株高、分枝数、主茎节数等与产量性状相关基因聚集在C2连锁群上[25]。 1.1.4 株型育种研究及进展 为提高粮食作物产量，科学家提出了超高产育种，主要包括作物理想株型育种和高光效育种，理想株型的培育是实现大豆高产的重要途径之一。盖钧镒提出：大豆理想株型不仅指株型受光态势的茎叶构成，还包括内在的光合特性、物质积累与分配等源、流、库的相应生理过程[26]。大豆理想株型要求高生物产量和收获指数，有限或亚有限生长习性，主茎上下结荚均匀，主茎、分枝结荚并重的空间产量分布；从全生育期动态发育角度则要求营养生长与生殖生长重叠期较短，叶面积前期扩展快、达到峰值时间短、后期下降缓慢，鼓粒期中上叶位功能期长，叶片光合速率高等[27]。杜文广等还结合多年育种实践，分别对大豆生产上大群体、中群体、小群体三个群体结构提出相应的理想光合生态型模式[28]。株型形态构建大多为种质育种改良、优良基因挖掘。郝再斌之前报道了一个大豆矮秆突变体 HK808，株高为原野生型东农 42 的 50%，为“矮秆密植”模式研究奠定了基础[29]；Zhang 等利用 γ 射线照射产生了一个突变体 Gmdwarf1，该突变体表现为矮秆、节间缩短、叶片变小、叶色加深[30]；苏伯鸿等将中品 661 进行 EMS 诱变后，得到一个理想株型突变体 itl，为育种提供了优良种质和理论依据[31]。 1.2 大豆主茎节数的遗传特性研究 多数研究认为主茎节数是一个较复杂的数量性状，具有较高的遗传力，有一定的母体效应，且与产量呈正相关[32]。陈恒鹤试验证明，主茎节数在 F1 代表现为显著杂种优势，到 F2代明显减退，而 F2代的主茎节数遗传还存在非加性效应[33]。闫昊等利用吉密豆1号等3个主茎节数和节间长度明显差异的大豆品种为实验材料，应用拟合分析法分析表明，F2代主茎节数频率分布呈现双峰曲线，变化幅度较广，总体而言，F1和 F2代与亲本主茎节数显著相关，且表现数量性状控制的过渡类型[34]。宁海龙等分析大豆四向杂交组合(垦丰 14×垦丰 15)×(黑农 48×垦丰 19)重组自交系群体主茎节数的主基因遗传模式和遗传效应，结果表明主茎节数受 1对主基因控制，遗传模式为 A1A2×A3A4，加性效应分别为16.82、-1.32和2.64，成分分布方差为 11.51，主基因方差为 3.05，主基因遗传率为21%[35]。明确大豆主茎节数遗传特性，并且对相关候选基因进行分析，可为进一步对大豆主茎节数生长发育机理奠定基础，为“理想株型”大豆新品种选育提供理论依据。 1.3 大豆主茎节数QTL定位研究 大豆主茎节数是指自子叶以上至主茎顶端的有效节数，在某一品种中相对稳定，遗传力较高，故可在育种早代进行单株选择[36]，因此，对主茎节数相关位点进行研究也十分重要。杨喆等利用 192 个单株的 F2分离群体、构建出一个大豆遗传连锁图谱，共检测出 2 个主茎节数相关 QTL 位点，一个位于 LG3 连锁群上，与 satt179 之间距离为3.01cM，另一个位于LG21连锁群的Satt293~Satt317之间，贡献率分别为10.1%、 8.6%[37]。Zhang等利用 RILs 中 184 个单株，鉴定出63个与大豆农艺性状相关的 QTL位点，其中有10个与主茎节数相关，且大部分定位在 C2连锁群上[38]。也有研究表明在 GM1-A1、GM3-B1、GM7-D1a 三个连锁群上发现了 7 个与主茎节数相关的 QTL 位点，可以解释7.12%~28.46%的变异率[39]。周蓉等对中豆 29×中豆 32 的 165 个重组自交系 F10进行试验，共检测到8个与主茎节数相关的 QTL，能够解释10.0%~19.2%的表型变异，2 年均在G连锁群上同一位置检测出 qNMS-16-1[6]。郑宝香等利用栽培品种“黑龙 37”与野生大豆“ZYD581”杂交后构建的 180 个 F2单株进行 QTL 分析，确定出一个位于 chr1 连锁群上Satt238 附近的 QTL位点[40]。 1.4 大豆主茎节数的遗传分析及候选基因分析(2):http://www.751com.cn/shengwu/lunwen_21906.html